此前，小編寫過一篇不理解為啥基因檢測前需提供病理免疫組化報告？聽實驗室心聲......。在該文章中，詳細介紹了為什麼在做基因檢測之前要進行病理質控，以及為什麼進行病理質控的時候需要提供免疫組化報告。那麼免疫組化報告中究竟藏著哪些「秘密」呢？小編基於最常見的肺癌，簡單的介紹一下免疫組化報告中的那些指標。
基因檢測之前進行的病理質控是指HE染色，即用蘇木精染液和伊紅染液先後給細胞染色，伊紅呈酸性能把細胞質中所含的胺類和蛋白質都染成紅色，蘇木精呈鹼性能把核糖體、細胞核和細胞質中含有DNA的部分都染成紫藍色。HE染色只能在鏡下肉眼識別一部分形態學非常典型的惡性腫瘤，而其他表現不典型，或者從形態學上不能明確是否是惡性腫瘤細胞的，就需要通過免疫組化來輔助診斷。在常規的腫瘤病理診斷中，有大概5%-10%的病例單靠傳統的HE染色很難做出明確的形態學診斷，當結合免疫組化後，尤其對於一些低分化或未分化的腫瘤，診斷的準確率可以達到50%-75%。就肺癌來說，對於大多數肺癌，通過對HE染色標本的形態學觀察，可區分出非小細胞肺癌和小細胞肺癌。但如果有些標本的形態學複雜難辨，或者要判斷非小細胞肺癌到底是腺癌還是鱗癌，或者想知道腫瘤的良惡性程度如何，以及肺部的腫瘤到底是原發性還是轉移性的等等，想要明確這些問題，就必須通過免疫組化檢查。
免疫組化，即免疫組織化學檢測（IHC），是病理診斷中一種常用的檢測手段，利用抗原抗體特異性反應原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（如酶、金屬離子、同位素等）顯示一定的顏色，並藉助顯微鏡觀察其顏色的變化，從而在抗原抗體結合部位確定組織、細胞結構的化學成分或化學性質，對組織或細胞中的未知抗原進行定位、定性及定量研究。
肺癌常用的免疫組化標誌物有哪些？
我們先來了解一下免疫組化報告中的「（+）」或「（-）」表示什麼？免疫組化報告中的（+）表示陽性，即檢測到該指標，（-）表示陰性，即未檢測到該指標。這些指標都是通過大量研究總結出來的、最能表征肺癌類型的免疫組化標誌物。
2023 CSCO非小細胞肺癌診療指南中，推薦的腺癌、鱗癌鑑別標誌物包括TTF-1、NapsinA、P40、CK5/6（P63）；小細胞癌標誌物包括CD56、Syno、CgA、INSM1、TTF-1、CK、Ki-67。
一、肺腺癌常用的免疫組化標誌物
1、TTF-1（甲狀腺轉錄因子-1）
75%~85%的肺腺癌表達TTF-1，且常呈瀰漫一致性的強陽性。TTF-1在肺腺癌中的表達與分化程度和組織學類型有關。總體而言，腫瘤分化程度越差，TTF-1越可能表達缺失，與組織學類型的相關性見表1。
TTF-1也表達於肺神經內分泌腫瘤（NETs），即小部分典型類癌（TC）、小部分非典型類癌（AC）、50%的大細胞神經內分泌癌（LCNEC）及85%的小細胞肺癌。通常認為肺鱗癌不表達TTF-1，因此，TTF-1主要用於肺腺癌和鱗癌的鑑別，不能鑑別肺腺癌和肺NETs。
2、Napsin A（新天冬氨酸蛋白酶A）
70%~90%的肺腺癌表達Napsin A，其敏感度和特異度均優於TTF-1，TTF-1和Napsin A是目前診斷肺腺癌最優秀的抗體組合之一。Napsin A在肺腺癌中的表達也與組織學類型、分化程度具有相關性（表1）。約3%的肺鱗癌表達Napsin A，肺NETs不表達Napsin A，因此可以用於肺腺癌和NETs的鑑別診斷。
3、CK7（細胞角蛋白7）
CK（細胞角蛋白）是一個大家族。幾乎100%的肺腺癌均表達CK7，因此CK7是肺腺癌診斷和鑑別診斷最常用的抗體之一，特別是在鑑別肺原發性腺癌和轉移性結直腸腺癌時，CK7常作為首選的抗體組合成員。但CK7的特異性較低，30%~60%的肺鱗癌表達CK7。在非肺源性腺癌中，CK7表達廣泛見於乳腺、胃、卵巢、胰腺、子宮、尿路上皮等多種器官和部位發生的腺癌，因此，在肺腺癌鑑別診斷時，需與其他特異度較高的抗體（TTF-1、Napsin A）聯合應用。
4、SP-A、SP-B（肺泡表面糖蛋白）
SP-A、SP-B 僅表達於約50%的肺腺癌，表達的組織學譜系較窄，主要表達於分化程度較高的具有Ⅱ型肺泡上皮細胞/ Calar細胞分化特徵的腺癌，在差分化肺腺癌中常常表達缺失，對於起源於較大支氣管、具有杯狀細胞特徵的腺癌（浸潤性黏液腺癌、膠樣腺癌等），其幾乎無診斷價值。
5、Cam5.2（包括CK8和CK18）
Cam5.2是常用的低分子量角蛋白，包括CK8和CK18。幾乎100%的肺腺癌表達Cam5.2，約35%的肺鱗癌和20%的肺大細胞癌（LCC）也表達Cam5.2。此外，Cam5.2可表達於人體幾乎所有類型的腺癌，特異性較低，Cam5.2在肺腺癌診斷和鑑別診斷中的應用價值均非常有限。
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二、肺鱗癌常用的免疫組化標誌物
1、p63、p40（ΔN p63）
p40是p63蛋白的一個亞型。p63在超過90%的肺鱗癌中呈強烈核表達，一般認為p63在肺腺癌中的陽性率為10%~33%，且常常呈局灶性低水平表達。p63診斷肺鱗癌的敏感度高達97.4%，但特異度較低，僅有72.8%。p40的敏感度與p63相似，但特異度優於p63，高達96.8%的肺鱗癌均強表達p40，僅在3%~ 5%的腺癌中表達，且常呈局灶陽性（<5%）。
2、CK5/6
75%~100%的肺鱗癌表達CK5/6，且與鱗癌的分化、分級無關，但也有研究顯示，20%的低分化鱗癌不表達或僅低表達。2%~33%的肺腺癌可表達CK5/6，但常呈局灶性低水平表達。值得注意的是75%~100%的胸膜上皮樣惡性間皮瘤也表達CK5/6，聯合應用其他特異性間皮瘤標誌物有助於二者的鑑別診斷。CK5/6與DSG3組合可以診斷92.6%的鱗癌。CK5/6表達需要與p63表達結合才能支持鱗狀細胞癌的診斷。
3、DSG3
近年來，DSG3也廣泛應用於肺腺癌和鱗癌的鑑別診斷，85%-90%的肺鱗癌表達DSG3，肺腺癌幾乎不表達（﹤2%）。檢測DSG3和NapsinA可區別85%以上的肺腺癌和鱗癌。檢測DSG3和CK5/6可以診斷92.6%的鱗癌。
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三、肺神經內分泌腫瘤常用的免疫組化標誌物
肺NETs占所有肺惡性腫瘤的20%~25%，包括類癌、大細胞神經內分泌癌和小細胞癌。類癌和小細胞癌的診斷主要依靠形態學特徵，而大細胞神經內分泌癌的診斷則常需要結合免疫標誌物。
1、CgA、Syn和CD56
CgA、Syn和CD56是神經內分泌腫瘤最常用的免疫組化標誌物組合。CgA全稱嗜鉻粒蛋白A是一種大分泌顆粒位於基質中的蛋白，特異性最強。CD56全稱神經細胞黏附分子，主要分布於神經外胚層來源細胞。Syn全稱突觸素，存在於神經內分泌細胞中，非神經內分泌瘤和肉瘤中不表達Syn，是目前普遍認為的診斷神經內分泌腫瘤敏感且特異性強的標記物。Syn在小細胞肺癌中表達較多，在肺鱗癌表達極少，因此可用於小細胞癌與肺鱗癌的鑑別診斷。
2022版CSCO小細胞肺癌診療指南在組織標本診斷原則中指出，神經內分泌腫瘤標記物包括CD56、Syn、CgA，在具有神經內分泌腫瘤形態學特徵的基礎上至少有一種神經內分泌免疫組化標記物明確陽性，且神經內分泌標記陽性的細胞數應大於10%腫瘤細胞量才可診斷神經內分泌腫瘤。當不具有神經內分泌腫瘤的組織學形態時，不推薦進行神經內分泌標記物染色。明確的鱗狀細胞癌或腺癌伴神經內分泌分化並不影響治療決策或預後。
2、INSM1
2023版CSCO小細胞肺癌診療指南里新增了INSM1（胰島素瘤相關蛋白1）作為小細胞肺癌的免疫組化標誌物，多項研究證明了INSM1在肺神經內分泌瘤具有較高的敏感性和特異性。而且INSM1是細胞核染色，而CgA、Syn和CD56是細胞質或細胞膜染色，因此對組織損傷較重、壞死明顯的標本，INSM1核染色更明顯，採用INSM1更有優勢。
3、Ki-67
Ki-67（增殖指數）有助於鑑別不同類型的神經內分泌瘤。典型類癌的Ki-67指數通常≤5%，屬於低級別；非典型類癌為≤20%，屬於中級別；大細胞神經內分泌癌為40%-80%，屬於高級別 NETs；小細胞肺癌的Ki-67指數通常為50-100%，屬於高級別，增殖活躍。
CSCO指南指出，依據 2021 版 WHO分類標準，肺神經內分泌腫瘤單獨依靠形態學，根據核分裂象和是否存在壞死進行分類，Ki-67 陽性指數目前還無法用來鑑別典型類癌及不典型類癌，但在小活檢標本中建議增加 Ki-67 檢測，有助於腫瘤科醫生進行治療決策，同時有助於區分不典型類癌和高級別神經內分泌癌的鑑別，並可避免將伴有機械性損傷的類癌、不典型類癌診斷為小細胞肺癌。
4、TTF-1
上文提到肺腺癌中的TTF-1，也表達於肺神經內分泌腫瘤，即小部分典型類癌、小部分非典型類癌、50%的大細胞神經內分泌癌及85%的小細胞肺癌。
CSCO指南指出，TTF-1在85%~90%的小細胞肺癌中呈陽性表達，當少數小細胞肺癌病例中不表達神經內分泌標記物時，結合形態、TTF-1瀰漫陽性、CK核旁點狀陽性顆粒特點及高Ki-67指數（一般為50%~100%）也有助於小細胞癌的診斷。應儘量減少診斷輔助檢查項目，以節約標本用於後續治療指導性檢查。
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免疫組化標誌物在NSCLC鑑別診斷中的應用
一、肺腺癌和鱗癌的鑑別診斷
TTF-1、Napsin A、CK5/6和p63（p40）是目前鑑別肺腺癌和鱗癌最常用的抗體組合之一。
二、肺腺癌與轉移性腺癌的鑑別診斷
肺是多種類型癌轉移最常見的部位之一，其中腺癌可能來自胃腸道、乳腺、卵巢、子宮內膜和前列腺等器官，未知原發部位的轉移性腺癌占所有肺癌的3%~5%。一些腺癌轉移至肺臟時仍然表達「器官特異性」的標誌物，藉助有效的抗體組合可以進行鑑別診斷。
肺腺癌常常需要與轉移性結直腸腺癌鑑別，一般通過肺腺癌特異性的標誌物如CK7、TTF-1和Napsin A，以及腸癌特異性標誌物如CK20、CDX2等易與轉移性結直腸癌鑑別診斷。但部分肺腺癌可表達「腸型」標誌物（CK20、CDX20）。另外，形態學上該類腺癌具有結直腸腺癌的特徵，「肺型」標記呈不同程度的表達（表1），使這類腺癌與肺內轉移性結直腸的鑑別診斷具有挑戰性。因此除了常規應用免疫標誌物組合以外，應綜合病史、臨床表現以及內鏡和影像學資料進行考慮。
除了結直腸腺癌外，轉移至肺的腺癌還可能來源於乳腺、腎臟、卵巢、前列腺等遠位器官。乳腺癌大部分表達ER/PR、GATA-3、GCDFP-15或者乳腺球蛋白（Mammaglobin）。GATA-3是乳腺癌的特異性標誌物，在47%~100%的乳腺癌中表達，其中90%以上的腺腔型乳腺癌表達GATA-3，但在三陰性乳腺癌中的陽性率較低（40%）。 肺腺癌不表達GATA-3，但部分東亞裔肺腺癌表達ER，因此，鑑別診斷時需結合TTF-1和Napsin A。肺腺癌不表達Pax-8，因此Pax-8表達強烈支持為轉移性腺癌。腎細胞癌強烈表達Pax-8，結合Pax-2及其標誌物有助於診斷腎細胞癌；Pax-8、ER和PR表達則支持卵巢漿液性腺癌的診斷；Pax-8、TG表達有助於甲狀腺癌的診斷；PSA和PSAP表達則強烈支持前列腺癌的診斷。
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三、肺癌與胸膜上皮樣惡性間皮瘤的鑑別診斷
肺腺癌和鱗癌有時需與胸膜上皮樣惡性間皮瘤鑑別，特別是對於胸腔鏡取樣的小活檢標本和胸水脫落細胞學標本。胸膜上皮樣惡性間皮瘤與肺腺癌以及鱗癌鑑別診斷的常用免疫標誌物詳見表3、4。
總結
通過上文的描述，相信大家對肺癌免疫組化報告有了進一步的了解。最後，我們再回到文章開頭提到的「腫瘤基因檢測在進行病理質控的時候為什麼需要提供免疫組化報告」這個問題。我們先來看一下這份免疫組化報告：
患者的右肺活檢樣本經HE染色光鏡下所見為「腫瘤細胞異型增生」，腫瘤細胞異型增生一般是指癌前病變，那麼是否為惡性腫瘤，以及屬於哪種腫瘤亞型，則需要結合免疫組化結果。病理診斷顯示CK5/6（部分+）、P40（+）、P63（+），因此結合免疫組化結果符合肺鱗狀細胞癌。
因此，通過這份病例，我們可以知道，在癌症組織樣本送檢基因檢測時，實驗室一般會進行病理質控HE染色，以確認癌細胞占比，然而病理醫師單靠HE染色結果有時無法確認是否為惡性腫瘤細胞，此時則需要結合免疫組化結果來進一步確認。
參考文獻：
劉標,周曉軍.非小細胞肺癌免疫組化標誌物專家共識(2014)[J].臨床與實驗病理學雜誌, 2015, 31(5):7.DOI:10.13315/j.cnki.cjcep.2015.05.001.