在2016年修訂的中樞神經系統腫瘤第四版WHO分類中，根據有關髓母細胞瘤生物學、基因組學和臨床行為的最新數據對髓母細胞瘤分類進行了調整。首次根據分子特徵（「基因學定義」類別）以及組織學特徵（「組織學定義」類別）對髓母細胞瘤進行分類。目前基因定義的類別包括WNT激活、TP53野生型SHH激活、TP53突變SHH激活和非WNT/非SHH激活(圖1(A))。組織學定義的類型包括典型、結締組織增生性/結節性（D/N）、間變性/大細胞性（LC/A）和髓母細胞瘤伴廣泛結節性（MBEN）。期望每個腫瘤都能從這兩種分類中得到診斷，當然這需要一種不同類型的結構化診斷，即在一份診斷報告中同時描述分子和組織學分類以進行分層或綜合診斷。本文回顧了髓母細胞瘤分類的最新進展，為這些腫瘤的免疫組織化學和分子檢測提供了一種實用的方法，並展示了如何利用關鍵的分子基因學發現進行綜合診斷。
圖1（點擊圖片可放大查看）
綜合診斷
儘管在過去的十年中，分子學數據已經成為常規診斷神經病理學的一部分，但如何將現代分子分析的結果（例如，下一代測序，拷貝數，基因表達譜數據）納入手術病理學報告的範式仍然缺乏。WHO分類系統不要求任何特定類型的報告格式，但國際癌症報告合作組織的指南建議採用模板文本，以獲得腫瘤可能的免疫組化或分子特徵列表，並標記為存在或不存在。在2016年WHO分類發布之前，建議採用「分層」診斷，且許多中心採用了這一建議。而綜合診斷的關鍵是將分子基因學類別放在診斷報告的最前位置，即使該數據比病理報告的其他數據更晚（即組織學類別或免疫組織化學結果）。報告模型允許對新檢測的結果進行替換整合，滿足診斷報告所需的靈活性。圖1(B)底部展示了髓母細胞瘤的綜合診斷示例。
髓母細胞瘤診斷報告應將分子亞群和組織學亞型與任何額外的分子數據（如：相關的基因拷貝數或突變數據）一起報告。對於髓母細胞瘤，可以採用多種多樣的檢測方法，並將結果納入綜合報告。例如，測序（無論是基於NGS還是Sanger）可檢測髓母細胞瘤SHH亞群的TP53突變和潛在的腫瘤易感性胚系突變。CTNNB1突變檢測可用於識別大多數WNT激活病例，但這不是必需的。在可行的情況下，進行基因拷貝數分析可以幫助預測。目前，對於髓母細胞瘤綜合診斷，預期應包含任何基於組織檢測的相關陽性或陰性結果。這具有特殊的臨床意義，因為髓母細胞瘤的某些組織學和分子特徵與預後相關，如圖4所示，下文的相關部分也進行了詳細討論。
必要和合理的診斷標準
2021年WHO分類為每一種腫瘤建立了一套「必要的」和「可取的」診斷標準。對於基因學定義髓母細胞瘤的診斷，信號通路激活（即WNT或SHH）或適當的DNA甲基化分析證據是必不可少的。髓母細胞瘤亞型的合理診斷標準尚未明確。如果腫瘤由於取樣不足或組織偽影而不能進行亞型分類，則髓母細胞瘤的診斷不另行規定（NOS）是合適的。
髓母細胞瘤分級
所有髓母細胞瘤根據其不經治療的預期結果被WHO分為4級。然而，這對於現代治療方法是否是正確的分類，是否適用於所有髓母細胞瘤亞型仍存在爭議。例如，在目前的治療方案下，WNT亞組髓母細胞瘤患者的生存率超過90%，這表明WHO 4級可能不準確。完全不分級的選擇仍然需要病理學家根據潛在的臨床結果決定。
基因學定義的髓母細胞瘤亞組
WNT激活型髓母細胞瘤：
根據轉錄數據，WNT激活髓母細胞瘤被認為起源於腦幹背側的祖細胞。這種亞型在解剖學上靠近腦幹，在MRI上有強烈的增強掃描，反映了血腦屏障的通透性。WNT激活髓母細胞瘤約占髓母細胞瘤的10%，大多數發生在年齡較大的兒童和成人(圖1(A))。
鑒於WNT激活髓母細胞瘤與其他亞型相比具有不同的臨床行為和良好的預後，識別該亞型尤為重要。對於WNT激活髓母細胞瘤患兒，目前治療的總生存率接近100%。這種生存優勢在成人患者中可能不那麼明顯。WNT激活髓母細胞瘤的一個罕見亞群發生在Turcot綜合徵背景下，原因是發生了胚系APC突變。這些罕見的腫瘤似乎與其他WNT激活髓母細胞瘤相比有同樣良好的預後。
WNT激活髓母細胞瘤必要的基本診斷標準是WNT通路激活，和/或相應的DNA甲基化分析。可以通過β-連環蛋白核免疫反應陽性來建立WNT通路激活的證據(圖3(D)和(E))。這種反應可以在整個腫瘤中觀察到，但偶爾只出現局灶性核β-連環蛋白免疫反應陽性（建議閾值為3%），因此限制了這種方法的敏感性。
在模稜兩可的情況下，正交試驗通常是非常有用的，且通過測序可以證明是否發生體系CTNNB1突變，該突變在WNT激活腫瘤中占比>85%。如果進行了CTNNB1突變的分子檢測，結果為陰性，那麼對於WNT激活髓母細胞瘤患者，應考慮是否可能發生胚系APC突變。6號染色體單倍體如果是唯一的拷貝數變異，也提示WNT激活髓母細胞瘤，在超過80%的病例中存在，即使6號染色體單倍體也可能存在於非WNT腫瘤中。除了核β-連環蛋白免疫反應陽性外，WNT激活腫瘤應表現出YAP1（核和胞質）和絲蛋白A（胞質）免疫組化反應陽性，但不需要GAB1免疫組化反應陽性(圖1(B))。在WNT激活腫瘤中，LEF1免疫組化顯示清晰、強的核免疫反應性，具有高度的敏感性，這可在β-連環蛋白難以確診的情況下提供幫助。然而，在SHH髓母細胞瘤中也有不同的LEF1陽性，因此不應對該免疫組化染色結果單獨進行分析。
值得注意的是，WNT激活腫瘤中TP53體系突變與較差的預後無關。基於基因表達和DNA甲基化數據的研究描述了WNT激活髓母細胞瘤的亞組，這些亞組的臨床意義目前尚不清楚。
SHH激活型髓母細胞瘤：
SHH激活髓母細胞瘤可能源於小腦外部顆粒細胞神經元群。一般來說，SHH激活髓母細胞瘤患者的年齡分布呈雙峰型，最常發生在嬰兒和成人。SHH激活髓母細胞瘤的分類需根據是否攜帶致病性TP53突變從而進一步確定。TP53野生型SHH激活髓母細胞瘤通常發生在大一點兒童的小腦外側部分，在嬰兒病例中經常累及蚓部。結節有時可以在X線片上發現，並典型地對應於MBEN組織學。
在SHH激活腫瘤中，癌症易感性綜合徵尤其重要，20%的病例與胚系致病變異有關。Gorlin綜合徵（痣樣基底細胞癌綜合徵，與PTCH1胚系突變相關）與SHH亞型的相關性已被長期認可。此外，在SHH激活髓母細胞瘤中觀察到胚系SUFU、ELP1和GPR161突變。遺傳諮詢和胚系分析通常適用於這些腫瘤，特別是對3歲以下的患者和/或有Gorlin綜合徵臨床症狀的患者。
在診斷SHH激活髓母細胞瘤方面，SHH通路激活（或相應的DNA甲基化分析）的證據是必不可少的。SHH通路的激活可以通過一組免疫組化染色來證明，包括YAP1（或絲蛋白A）和GAB1，二者均需在SHH激活腫瘤中表達。GAB1和絲蛋白A應顯示細胞質免疫反應陽性，YAP1核染色和細胞質染色均應顯示陽性。SHH激活髓母細胞瘤中的β-連環蛋白表達應該只顯示在細胞質中，而核中沒有(圖3(F))。另外，RNA表達分析可以用於分子亞組的分類。TP53野生型SHH激活髓母細胞瘤預後不良的關鍵標誌包括MYCN擴增、GLI2擴增、14q染色體丟失和轉移性疾病。而MBEN組織學(廣泛結節的髓母細胞瘤，詳細如下文)與良好的預後相關。
在10-15% SHH激活髓母細胞瘤中存在TP53突變，這些腫瘤應歸類為TP53突變SHH激活髓母細胞瘤。與TP53野生型SHH髓母細胞瘤的雙峰年齡（好發於嬰兒和成人）分布不同，TP53突變SHH激活髓母細胞瘤最常見於兒童或青少年。軟腦膜擴散是TP53突變SHH激活髓母細胞瘤的共同特徵，經常表現為間變性形態(70%)，或較少表現為結締組織增生性/結節性伴局灶性間變性。患者預後特別差，需要不同的治療方法。與其他SHH激活髓母細胞瘤一樣，該類腫瘤表現出YAP1（或絲蛋白A）和GAB1的免疫反應陽性，而沒有β-連環蛋白核表達。p53蛋白的免疫組化是一種可接受但不是精準的TP53突變狀態的替代檢測方法，特別是在廣泛存在p53強核免疫反應(圖3(H))或p53表達完全缺失的情況下。在這些腫瘤中，TP53突變經常(>50%)出現在胚系細胞中（Li-Fraumeni綜合徵），其餘的完全是體系。在TP53區域的17p缺失和雜合性損失是其他相關特徵。DNA甲基化和表達分析不能區分TP53突變SHH激活髓母細胞瘤和TP53野生型SHH髓母細胞瘤。
非WNT/非SHH激活型髓母細胞瘤：
不屬於上述類別的髓母細胞瘤被指定為「non-WNT/non-SHH」，對應於已確定的分子亞群「group 3」和「group 4」。這一大類占了髓母細胞瘤病例的大多數。雖然在大多數情況下，可以通過DNA甲基化或RNA表達分析來確定組3或組4的分類，但這些亞組之間也看到了一些重疊，最近的附加亞分類表明從組3到組4有一個範圍，其中有8個可能的亞型。如下所述，廣泛用於髓母細胞瘤亞組的免疫組化染色不能區分組3和組4(圖1(B))。甲基化分析和RNA表達分析通常可以將腫瘤分為組3或組4，和/或提供進一步的亞分類。在某些情況下，可能需要區分組3和組4，例如根據兩組之間不同的高危分子特徵改變治療方法(圖4)。
與在所有髓母細胞瘤中的占比(25%)相比，組3腫瘤在嬰兒中的占比過高(40%)。組3腫瘤預後不良指標包括MYC擴增、17q等臂染色體和轉移性疾病。組4髓母細胞瘤是最常見的類型（在所有髓母細胞瘤中的占比約35%）。組4腫瘤預後不良的標誌包括診斷時患者年齡小（嬰兒期）和轉移性疾病，預後良好的標誌包括11號染色體丟失和17號染色體增加。非WNT/非SHH激活型髓母細胞瘤伴胚系腫瘤易感性的報道很少見，但一般認為二者並沒有很強的相關性。
組織學定義的髓母細胞瘤亞組
2021版WHO分類列出了髓母細胞瘤的組織學分類，目的是以分層的方式報告這些分類，並將其分為分子亞組。如果基於分子的亞組信息不可用，且即使通過免疫組化，那麼形態學亞組可以獨立報道。在分子亞組和形態學亞組都不能評估的情況下，可以使用NOS。
大多數髓母細胞瘤具有典型的形態學特徵（圖2(A)至(C)），以所謂的「小圓藍細胞」外觀為特徵，易於識別有絲分裂圖像和凋亡小體，缺乏其他形態學類別的典型特徵（即網狀蛋白浸潤結節和細胞學間變性）。只有少數典型的髓母細胞瘤含有發育良好的Homer Wright玫瑰花結（見圖1(B)，例如非WNT/非SHH H＆E）。
圖2（點擊圖片可放大查看）
促結締組織增生型/結節型(D/N)髓母細胞瘤表現為中度細胞性腫瘤的結節區，被密集細胞區和細胞間網蛋白包圍，呈現包被樣外觀(圖2(F))。網織蛋白染色是識別這種亞型的關鍵，結節間區Ki-67標誌物升高也支持該診斷。需要注意的是，任何髓母細胞瘤累及蛛網膜下腔都可能導致粘連增生(圖2(D))，在確定這一組織學類別之前，應注意鑑別明確的結節(含蒼白島(pale islands)：含有圓形規則核和豐富細胞質的細胞(圖2(E)至(G))。具有廣泛結節的髓母細胞瘤(MBEN)也具有結節結構(圖2(H))，但應表現為包含更多分化腫瘤細胞的更大結節(圖2(I))。這種亞型是最罕見的組織學類型，在所有髓母細胞瘤中占比不到5%。D/N和MBEN亞型在3歲以下的患者中更為常見（D/N占比約50%，MBEN占比約20%），並且在較小年齡兒童中與極好的預後相關。兩者在很大程度上都局限於SHH激活型。需要SHH通路激活的證據才能正式將其列為該診斷類別，因為其他分子亞群中偶爾也會出現結節。
具有大細胞/間變(LC/A)形態的髓母細胞瘤是由帶有顯著核仁的大細胞外觀(圖3(C))和/或由細胞核增大、明顯的多形性和細胞-細胞包裹構成的細胞學間變(圖3(A)和(B))定義的。對Pediatric Oncology Group中髓母細胞瘤的回顧性分析顯示，中度和重度發育不全是預後較差的因素，發育不全的程度也是影響預後的重要因素。在大多數的腫瘤標本中應存在間變性形態，高核分裂指數和凋亡指數是這一類型的典型特徵。該腫瘤亞型在診斷時通常表現為轉移性疾病(60-70%)，容易復發和腦脊液擴散。LC/A髓母細胞瘤的5年無進展生存率為30-40%。值得注意的是，具有顯著核仁的大細胞外觀高度提示MYC或MYCN擴增，應提示進行FISH檢測或拷貝數分析。
圖3（點擊圖片可放大查看）
髓母細胞瘤診斷和報告的實用方法
當遇到小兒後顱窩胚胎性腫瘤時，髓母細胞瘤是首要考慮的。應對SMARCB1/INI1（和罕見的SMARCA4/BRG1）進行常規免疫組化以排除不典型畸胎樣/橫紋肌樣腫瘤(AT/RT)的可能性，尤其是對於3歲以下的患者。SMARCB1/INI1應在髓母細胞瘤細胞核內表達，在AT/RT中的免疫反應性特異性喪失，反映SMARCB1失活。另一個需要考慮的問題是具有多層玫瑰花結的胚胎腫瘤（ETMR），尤其是在幼兒中，該類型腫瘤通常顯示LIN28A的免疫反應性。ETMR診斷的其他依據是廣泛富含神經膠質區域和小管腔周圍多層的腫瘤細胞玫瑰花結。
一旦確診為髓母細胞瘤，免疫組化panel可以幫助亞分組包括GAB1、YAP1、絲蛋白A和β-連環蛋白。網織蛋白染色有助於突出結締組織區域，並有助於評估腫瘤結節的存在和範圍(真結節應近周被網織蛋白包圍，圖3(G)。Ki-67可能有助於突出腫瘤的增生性區域，如D/N髓母細胞瘤的結節間區域，或LC/A腫瘤的發育不全程度。使用免疫染色panel應允許分層或綜合診斷，包括組織學定義和基因學定義的類別(見圖1(B)中的示例)。建議進行額外的檢測，以確定具有重要預後意義的分子基因特徵。這一輔助檢測類別中常用的分析方法是檢測MYC（8q24.21）和MYCN（2p24.3）的FISH，以及檢測CTTNB1和TP53的單基因測序。NGS panel通常具有提供包括其他相關癌症基因的優勢，如SHH通路中的基因，這可能有助於識別潛在的胚系病例，而拷貝數分析可能與髓母細胞瘤的預測相關性更大。如果可行的話，DNA甲基化分析或基於RNA表達的分析可用於分型，這兩種技術均可用福馬林固定的石蠟包埋樣本。DNA拷貝數評估可以通過大量的檢測來進行，這不僅有助於檢測MYC/MYCN擴增，還有助於檢測6 號染色體單體型（WNT激活型）和17q等臂染色體、11號染色體丟失、GLI2擴增和17號染色體增加(非WNT/非SHH激活型)。
最終，整合組織學和分子學診斷的目的是綜合腫瘤所有相關得預後信息。在如今髓母細胞瘤實踐中，這種預後信息可能會以基因擴增、功能缺失突變或組織學特徵（如發育不全）的形式出現，因此簡明而完整的報告是絕對必要的。臨床表現最差的髓母細胞瘤類型為MYC擴增組3腫瘤、TP53突變和/或MYCN擴增或GLI2擴增SHH激活LC/A腫瘤。髓母細胞瘤預後標誌物的分類如圖4。
圖4（點擊圖片可放大查看）
最後，對於部分病例，推薦胚系檢測是病理報告的重要組成部分。癌症易感性是兒童期癌症（包括髓母細胞瘤）的一個重要因素(圖4)。對於被診斷為WNT激活髓母細胞瘤但不攜帶CTNNB1 3號外顯子突變的兒童，可以建議進行APC測序。SHH激活腫瘤通常與胚系突變有關，包括SUFU、PTCH1、TP53、PALB2和BRCA2。在罕見病例中，非WNT/非SHH激活型腫瘤可能與PALB2或BRCA2突變相關，這些患者很可能有明顯的癌症家族史。事實上，對於那些p53免疫組化陽性的SHH激活髓母細胞瘤患者、3歲以下的SHH激活髓母細胞瘤患者，或者任何具有明顯腫瘤家族史的癌症患者，都應該考慮進行胚系檢測。
髓母細胞瘤診斷分子檢測的作用
世界各地的病理學家在使用下一代測序、SNP陣列、甲基化陣列等檢測平台方面存在差異，這使得WHO不願對使用哪種類型的檢測平台來診斷髓母細胞瘤進行規定。雖然新的檢測平台可以對髓母細胞瘤腫瘤生物學有更深入的了解，但兒科腫瘤醫生可操作的大多數診斷信息仍然可以通過光鏡分析和有限的輔助研究（如免疫組化和FISH）來獲得。一些研究中心可能會選擇將所有髓母細胞瘤進行分子檢測，而其他研究小組可能會選擇只在經免疫組化評估的特定病例中進行特定的分子研究。
2021年第5版WHO分類尚未對可能存在於非WNT /非SHH激活型類別中的亞組確定足夠的臨床意義。臨床試驗目前正在開始，因此確定髓母細胞瘤患兒亞型（組3與組4）之間的差異將是很重要的，甲基化陣列和RNA表達分析都可提供有用的信息。考慮到亞組之間的差異，選擇合適的輔助檢查可能會令人困惑，因此圖4總結了癌症易感性的關鍵預後生物標誌物和指標。該醫療中心對髓母細胞瘤的當前治療方法總結如圖5。
圖5（點擊圖片可放大查看）
臨床上重要的髓母細胞瘤亞組的劃分在未來幾年可能會繼續發展，但執業病理學家的總體方法將保持不變。目的是提供一個分層的、綜合的診斷，包括相關的組織學和分子基因學特徵（包括提示胚系腫瘤易感性綜合徵的變異），以實現準確的診斷並為患者的最佳護理提供相關的預後信息。
參考文獻：
Cotter JA, Hawkins C. Medulloblastoma: WHO 2021 and Beyond. Pediatr Dev Pathol. 2022 Jan-Feb;25(1):23-33. doi: 10.1177/10935266211018931. PMID: 35168417.