泛癌種靶向藥的獲批擴大了晚期實體瘤患者的治療選擇。FDA批准PD-1抑制劑帕博利珠單抗和TRK抑制劑拉羅替尼和恩曲替尼，為所有晚期實體瘤患者進行NGS檢測提供了依據，即使是其他方案難治的患者也可能實現臨床獲益。作為概念驗證研究，本病例描述了一例64歲的三陰性乳腺癌女性患者，多線治療無效，NGS檢出罕見突變後接受靶向治療，獲得顯著緩解。患者最初進行了局限性乳腺癌治療，5年後出現轉移，經過四線治療，包括免疫治療、基於抗體-藥物偶聯物的治療和化療，快速進展。胚系基因檢測正常。最終，83基因細胞游離DNA（cfDNA）NGS檢出兩個NTRK3融合：與罕見分泌性乳腺癌相關的ETV6-NTRK3融合，以及在乳腺癌中尚未描述過的CRTC3-NTRK3融合。對肝活檢組織樣本進行全外顯子組測序和RNA-seq，證實了ETV6-NTRK3和CRTC3-NTRK3融合。開始TRK抑制劑拉羅替尼治療，僅2個月後就實現臨床和影像學顯著獲益。本病例表明了晚期癌症患者進行NGS檢測的潛在巨大益處。
背 景
針對神經營養性酪氨酸激酶（NTRK）1/2/3基因融合的靶向治療是癌症治療的重要里程碑。2018年，TRK抑制劑拉羅替尼獲批用於NTRK 1/2/3基因變異的實體瘤患者，成為FDA批准的第二款泛癌種靶向藥。次年，恩曲替尼同樣獲批泛癌種NTRK 1/2/3融合適應症。這些批准都是基於籃子試驗，入組患者攜帶NTRK融合，無論組織來源。⩾3級不良事件發生率較低，拉羅替尼常見不良反應包括貧血（11%）、中性粒細胞減少症（7%）、AST/ALT升高（7%）和體重增加（7%）。恩曲替尼常見不良反應包括體重增加（10%）和貧血（12%），神經系統障礙（4%）是最嚴重的治療相關不良事件。
總體來看，NTRK融合在乳腺癌中發生率較低，主要見於非常罕見的分泌性乳腺癌，ETV6-NTRK3融合是該亞型特異性變異。分泌性乳腺癌往往呈惰性，很少發生轉移。本文描述了一例絕經後女性患者，診斷為具有分泌特徵的轉移性三陰性乳腺癌（TNBC），經過多線治療疾病進展。基於血漿的細胞游離DNA（cfDNA）基因檢測發現兩個NTRK融合：與分泌性乳腺癌相關的ETV6-NTRK3融合，以及未曾在文獻中報道過的染色體內CRTC3-NTRK3融合。接受拉羅替尼治療，2個月後影像學顯著緩解，儘管先前多線治療後疾病進展。
病 例
2014年，一名64歲女性觸摸到左乳腫塊，檢查後診斷為II級、雌激素受體弱陽性（ER+，10%）、孕激素受體陰性（PR-）、人表皮生長因子受體2陰性（HER2-）乳腺癌。腫瘤主要呈微囊狀結構，有實質性和乳頭狀區域，多邊形細胞具有嗜酸性空泡狀細胞質，囊腔可見密集嗜酸性分泌物。基於這些發現，診斷為具有分泌特徵的浸潤性導管癌（IDC）（圖1）。腫塊廣泛侵犯胸肌；因此，接受了劑量密集多柔比星和環磷醯胺新輔助治療，隨後每周一次紫杉醇×12（ddACT），接著進行了左乳手術並切除了三個陰性前哨淋巴結。最終病理顯示2.6 cm腫塊，浸潤部位沒有明確反應。最終分期為ypT2ypN0M0。接受了輔助放療，並完成了5年阿那曲唑治療。
圖1. (a) ETV6-NTRK3融合示意圖；(b) CRTC3-NTRK3融合示意圖；(c) 腫瘤主要呈微囊狀結構；(d) 標本由多邊形腫瘤細胞組成，具有大的圓形至橢圓形核和嗜酸性空泡狀細胞質，囊腔可見密集嗜酸性分泌物。
2020年，術後5年，出現疼痛性頸淋巴結腫大。PET/CT掃描顯示胸骨周圍復發性侵蝕性胸壁疾病、雙肺轉移和鎖骨上淋巴結轉移。後者活檢證實為轉移性乳腺癌，ER-，因此為TNBC，PD-L1表達1%（腫瘤細胞），Ki-67 20%。胚系基因檢測顯示ATM、BRCA1、BRCA2、CDH1、CHEK2、NBN、NF1、PALB2、PTEN、STK11和TP53突變陰性。
隨後，接受了多線治療，每線治療早期重新分期均評估為疾病進展。治療包括阿替利珠單抗/nab-紫杉醇（5個月後進展）、吉西他濱/卡鉑（3個月後進展）、基於戈沙妥珠單抗的治療（2個月後進展）和艾立布林（2個月後進展）。對胸壁腫塊進行了兩次活檢，結果顯示IDC，可見胞漿內粘蛋白。
在開始基於戈沙妥珠單抗治療之前，使用Guardant360進行了外周血cfDNA NGS檢測，覆蓋83個基因。檢出ETV6-NTRK3融合，變異丰度（MAF）為3.8%。3個月後，在戈沙妥珠單抗治療失敗後，對新的血液樣本進行重複Guardant檢測，發現ETV6-NTRK3融合MAF從3.8%增加到10.9%，並且還發現了新的CRTC3-NTRK3融合，MAF為3.2%。進行了肝活檢，進行BostonGene檢測（基於組織的全外顯子組測序和RNA-seq平台），證實了ETV6-NTRK3和CRTC3-NTRK3融合（圖1）。
隨後，開始拉羅替尼治療。2個月後的複查掃描顯示，肺、胸膜、淋巴結和胸壁轉移病灶顯著改善，首次實現客觀緩解。CA 15-3，之前持續上升，也從最高時206 IU/mL降到了48 IU/mL。隨後血液樣本重複Guardant檢測顯示，ETV6-NTRK3融合MAF從10.90%降至0.40%，CRTC3-NTRK3融合MAF從3.20%降至0.07%（圖2）。拉羅替尼耐受情況較好，未進行劑量減少或調整。主要副作用有貧血和水腫。繼續使用拉羅替尼7個月，疾病控制情況良好。不幸的是，與治療無關，由於已有骨轉移，發生多次骨折，導致疾病負荷重。最終，患者和家人選擇了轉為安慰措施，之後患者去世。
圖2. (a) 患者的臨床時間線；(b) 左側圖像：胸部CT顯示多個肺和胸膜轉移病灶，右側圖像：拉羅替尼治療2個月後這些病灶顯著改善。兩個NTRK3融合MAF降低。
討 論
本文描述了一例TNBC患者，多線治療後疾病進展，直到基因檢測發現兩個NTRK融合，開始TRK抑制劑治療，2個月後臨床獲益顯著。通過血漿基因檢測發現NTRK融合，從而能夠進行匹配的靶向治療，這對轉移性乳腺癌患者，特別是分泌性組織學亞型的患者來說，是值得考慮的。
NTRK融合較為罕見，現在已引起極大關注，因為攜帶NTRK融合的患者可以接受相應靶向治療，不論癌症組織起源。然而，NTRK融合在成人實體瘤中的檢出率僅約0.3%。NTRK 1/2/3編碼TrkA/B/C，這些蛋白的融合導致配體非依賴性二聚化和隨後下游MAPK和PI3K-AKT通路激活。對FoundationCORE資料庫295000多例癌症患者進行的一項大型研究也發現，約0.30%的實體瘤存在NTRK融合，覆蓋45種不同癌症889例患者，包括88個不同的融合伴侶。在295例融合伴侶已知的成人中，ETV6最常見（n = 78, 26.4%）。在乳腺癌中，14例患者伴侶為ETV6（14.7%）。有趣的是，本文患者CRTC3-NTRK3融合涉及的融合伴侶在這些大型數據集中似乎沒有描述過。ETV6-NTRK3是染色體間融合t（12；15）（p13；q25），而CRTC3-NTRK3是染色體內融合。不幸的是，我們沒有患者最初標本的NGS數據，儘管考慮到分泌性病理，ETV6-NTRK3融合很可能已經存在。後來，cfDNA檢測在ETV6基因另一個融合位點發現低MAF ETV6-NTRK3融合，對cfDNA NGS的更深入研究提示，這些基因變異實際上可能是交叉的，一個基因的外顯子可能與另一個基因的內含子融合，多個融合reads可能反映了更複雜的事件（圖3）。
圖3. (a) NTRK3、EVT6和CRTC3基因示意圖；(b) cfDNA檢出的最初ETV6-NTRK3融合示意圖；(c) cfDNA檢出的第二種ETV6-NTRK3融合示意圖；(d) cfDNA檢出的CRTC3-NTRK3融合示意圖；(e) cfDNA檢出的NTRK3-NTRK3內部融合。
拉羅替尼和恩曲替尼的出現開啟了新的腫瘤治療格局。拉羅替尼的組織不確定批准依據的是三項單臂籃子試驗：LOXO-TRK-14001（NCT02122913）、SCOUT（NCT02637687）和NAVIGATE（NCT02576431）。對這三項研究的綜合分析顯示，55例被評估為不可切除或轉移性實體瘤患者的總體緩解率（ORR）為75%（95% CI: 61-85%），隨後對153例患者的分析發現ORR為79%（95% CI: 72-85%），其中24例患者（16%）達到完全緩解。恩曲替尼的批准同樣基於對三項單臂臨床試驗的綜合分析：ALKA-72-001（GO40783）、STARTRK1（NCT02097810）和STARTRK2（NCT02568267）。在這項分析中，54例成人患者的ORR為57%（95% CI: 43–71%），63%的患者緩解持續時間⩾6個月 。有趣的是，批准並不取決於融合伴侶。這些新的組織不確定適應症開啟了精準醫療新領域。
可以從這個獨特的病例學到幾點。首先，基於患者切除樣本顯微特徵，診斷為具有分泌特徵的IDC，這應該是進一步進行基因檢測的第一條線索。與典型IDC相比，分泌性乳腺癌在組織學和基因組學上與唾液腺癌更相似，均存在ETV6-NTRK3基因融合。此外，雖然實體瘤中NTRK融合總體上很少見，但在分泌性乳腺癌中，NTRK-ETV6融合是診斷的關鍵。病理學特徵結合ETV6-NTRK3融合，促進罕見分泌性乳腺癌的診斷。目前，尚無NTRK融合轉移性乳腺癌基於生物標記物使用TRK抑制劑的已發表研究。
分泌性乳腺癌在乳腺癌中占比不到1%。這種亞型最初在兒童和青少年中被描述為「青少年癌」。然而，後來發現，9歲至69歲（中位年齡25歲）的患者也報告了具有相同分泌特徵的類似癌症；使其被重新歸類為「分泌性乳腺癌」。有趣的是，乳腺癌初始驅動突變一直很難明確，而ETV6-NTRK3融合是一個已知例外，解開了乳腺癌基因組進化謎團的一部分。分泌性乳腺癌是兒童和青少年中描述過的少數幾種乳腺癌之一。
分泌性乳腺癌通常為三陰性，與非分泌性乳腺癌相比，通常表現為侵襲性較低，轉移風險較低，且伴隨基底樣免疫表型的三陰性特徵。這種惰性生長模式與唾液腺癌相同。本文患者腫瘤的自然病程更具侵襲性，術後5年發生遠處轉移，並對多線系統治療耐藥。本病例突出了關於罕見疾病的一個有趣觀點。由於缺乏來自大型人群研究的數據，通常很難全面分析罕見疾病的自然史範圍。那麼就有一個問題，該患者疾病是否真的非典型，還是相關文獻較少的不同表型。此外，儘管病程具有侵襲性，靶向NTRK融合治療是控制該患者其他方案難治疾病的關鍵。
本文患者在免疫治療後疾病快速進展也可能是NTRK融合實體瘤的特徵性行為。一項前瞻性篩查26000例患者的大規模單中心研究發現了76例NTRK融合，與成人人群中0.28%的發生率一致。這似乎是有臨床數據的NTRK融合相關最大研究。分泌性乳腺癌占NTRK陽性病例的大多數，非分泌性乳腺癌僅占0.08%（3/3775）。在所有腫瘤類型中，NTRK融合患者的腫瘤突變負荷往往較低，免疫治療總體療效往往較差，除了在結直腸癌中，微衛星不穩定與NTRK融合似乎同時發生。通過BostonGene平台進行的全轉錄組測序發現了成纖維細胞活化的腫瘤微環境，這與免疫治療療效較差相關。
多項NTRK融合相關研究表明，NTRK融合是致癌驅動變異，往往與其他驅動變異相互排斥。NTRK融合也常為克隆事件;上述前瞻性篩查隊列包括17例接受連續活檢的患者，其中14例患者連續活檢發現新獲得的融合。亞克隆NTRK融合也被報告為假定的獲得性脫靶耐藥機制，例如，在非小細胞肺癌中，酪氨酸激酶抑制劑治療後，與EGFR驅動突變同時存在。
鑒於分子靶向治療的重要性，人們越來越認識到需要靈敏度高的方法，來檢測可能會影響生物學和療效的新獲得的分子事件。有幾種檢測NTRK融合的方法，包括基於DNA的NGS、基於RNA的NGS，免疫組化（IHC）和螢光原位雜交（FISH）。在這些技術中，RNA測序似乎靈敏度最高。在上述MSK-IMPACT檢測中，26%（12/46）的患者RNA檢出的融合DNA沒有檢出。所有這12例患者都是由於NTRK2/3內含子內斷點，這些內含子區域太大，基於DNA的MSK-IMPACT檢測沒有完全覆蓋。這種差異突出了基於DNA的NTRK檢測的局限性。儘管如此，基於DNA的測序的靈敏度為81.1%，特異性為99.9%。IHC的特異性為81.1%，但檢測NTRK3融合的靈敏度僅為79%。此外，在融合頻率高的情況下，IHC的特異性較低，如分泌性乳腺癌和唾液腺癌（82%和52%）。因此，IHC與更多假陰性和假陽性相關。一項研究納入了305例TNBC患者，IHC檢測發現32例（11.1%）陽性病例。進行FISH檢測來驗證，發現13例患者攜帶NTRK融合。然而，隨後的NGS和RT-PCR檢測顯示，除一例患者外，其餘患者均為NTRK融合陰性。ESMO指南推薦NGS作為標準方法，如果IHC是初始檢測方法，隨後應進行NGS檢測。類似地，基於組織樣本的NGS平台，通過FoundationOne檢測NTRK融合，FDA批准了拉羅替尼的伴隨診斷。
由於這些罕見基因變異可治療，檢出這些變異對於患者很重要，尤其是對於TNBC等異質性疾病患者。儘管先前認為TNBC是一種無可靶向治療變異（如ER、HER2）的疾病，但本病例表明，事實上，TNBC人群中有患者獲益於靶向治療，特別是分泌性組織學亞型患者，由於固有的NTRK3融合，可能臨床獲益顯著。因此，最近美國臨床腫瘤學會（ASCO）發布了關於乳腺癌生物標記物檢測的最新指南，以及一項暫行推薦：如果晚期實體瘤患者可能存在不止一種生物標誌物可導致靶向治療，應接受體細胞檢測。鑒於帕博利珠單抗獲批用於微衛星不穩定和/或高腫瘤突變負荷組織不確定癌症患者，以及類似地，拉羅替尼和恩曲替尼獲批用於NTRK融合患者，推薦所有晚期實體瘤患者進行體細胞檢測，這也反映在當前NCCN指南3.2022版中，其中推薦IV期（M1）或復發性乳腺癌進行全面胚系和體細胞檢測，看是否可能獲益於額外靶向治療。隨著對乳腺癌患者基因圖譜和可治療變異的了解不斷深入，我們認為患者的基因檢測結果可以指導治療，可能實現臨床獲益，正如本病例患者。
參考文獻：
Medford AJ, Oshry L, Boyraz B, et al. TRK inhibitor in a patient with metastatic triple-negative breast cancer and NTRK fusions identified via cell-free DNA analysis. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 2023;15. doi:10.1177/17588359231152844