食管鱗狀細胞癌（ESCC）在新輔助治療期間需要準確的腫瘤負荷監測方法來指導治療。日本慶應大學醫學院開展了一項研究，探索了在接受新輔助化療（NAC）+食管切除術的患者中，血漿循環腫瘤DNA（ctDNA）的臨床效用。從接受NAC+食管次全切除術的組織學診斷為ESCC的患者中，縱向收集了血漿樣本用於ctDNA檢測，此外，還收集了原發性腫瘤樣本。對血漿和原發性腫瘤樣本進行了NGS檢測。評估了局部晚期ESCC患者ctDNA變化與病理緩解和復發的相關性。在13例患者的治療前樣本中，11例患者（85%）ctDNA和原發性腫瘤檢出多個一致突變，這些患者被歸類為治療前ctDNA陽性。NAC後ctDNA陽性率與病理緩解相關（緩解者，25%; 未緩解者，100%; p = 0.007）。對16例患者進行的分析顯示，術後ctDNA陽性患者復發風險顯著增加，ctDNA陰性組和ctDNA陽性組的1年無復發生存率分別為90%和0%（p = 0.0008）。在2例術後復發患者中，ctDNA檢出時間比影像學診斷時間早約5.5個月。本研究表明，ctDNA可作為預測ESCC病理緩解和術後復發的潛在標誌物。為了驗證本研究結果，我們正在準備一項多中心前瞻性研究。
研究背景
食管癌是全球癌症相關死亡的第六大原因，5年生存率低於25%。為了改善生存結果，已開發了多學科治療，包括手術、化療和放療。對於可手術切除的食管癌，術前治療+手術是標準治療方案。CROSS試驗顯示，與單獨手術相比，新輔助放化療（NACRT）+食管切除術帶來生存優勢，基於此，西方國家已採用NACRT術前治療。然而，日本推薦進行不含放療的新輔助化療（NAC）。基於JCOG9907研究，順鉑+5-氟尿嘧啶（CF）新輔助治療是標準方案。最近，三臂III期JCOG 1109試驗顯示，CF+多西他賽（DCF）新輔助治療優於CF新輔助治療。該試驗表明，比CF新輔助治療相比，DCF（但非NACRT）新輔助治療延長了局部晚期食管鱗狀細胞癌（ESCC）的總生存期，毒性可控。最近，來自85所日本癌症中心的食管癌真實世界數據證明了DCF新輔助治療帶來的生存優勢。三藥化療除了改善術後生存率外，還提高了緩解率，病理完全反應（pCR）率更高。DCF治療患者的pCR率約為20%。此外，免疫檢查點抑制劑新輔助治療有望進一步提高pCR率。
食管癌治癒方法以手術切除為主，但食管切除術具有高度侵入性，並且有術後併發症風險。器官保留方案包括無手術的積極監測，在NACRT為標準方案的西方國家用於臨床完全緩解的患者。SANO試驗評估了器官保留方案的安全性和有效性。為了選擇哪些患者可以保留器官，應準確評估腫瘤負荷。然而，目前計算機斷層掃描 （CT）、食管胃十二指腸鏡檢查 （EGD） 和正電子發射斷層掃描 （PET） 聯合檢查的準確性並不令人滿意。在接受NAC治療的患者中，38%的緩解者NAC後沒有顯示粘膜殘留病灶，提示常規活檢無法發現NAC後的殘留病變。因此，需要可以精確反映腫瘤負荷的監測方法。
術前發現pCR具有臨床價值，識別病理緩解者也具有臨床價值。我們之前報道過病理緩解是ESCC的重要預後因素。此外，術後復發的病理緩解者出現局部復發，沒有出現遠處轉移，可以指導NAC治療緩解者保留器官，進行後續CRT。一項多中心II期試驗（CROC試驗）評估了選擇合適的患者在DCF後接受CRT、省略手術的有效性。顯著緩解者後續進行了CRT，90%達到完全緩解，3年時的總體器官保留生存率為 45%。然而，仍然缺乏可靠的檢測方法來評估術前病理緩解者。
在幾種類型癌症中，循環腫瘤DNA（ctDNA）檢測是監測腫瘤負荷的有前途的方法。ctDNA檢測的優點包括易於重複採樣，降低侵入性，能夠靈敏反映癌症動力學。Azad等人的研究顯示，在食管癌中，放化療後ctDNA監測有助於發現早期腫瘤復發。
因此，基於ctDNA的精準腫瘤監測對術後DCF新輔助治療策略主要有兩大臨床意義。首先，能夠定量和高度準確了解DCF新輔助治療後的緩解情況，預測預後。此外，根據CROC試驗結果，當患者強烈傾向於器官保留時，或許能夠建議隨後根治性CRT作為一種選擇。其次，可以通過術後ctDNA預測復發。術後不進行輔助治療是標準方案，但術後納武利尤單抗或TS-1也可作為一種選擇。然而，其有效性尚不明確，如果ctDNA能夠準確識別復發風險低的人群，則可以確定哪些人群不需要輔助化療。
據我們所知，目前尚無關於ctDNA評估ESCC患者NAC治療療效的研究。本研究探索了血漿ctDNA在ESCC新輔助治療中的臨床效用，評估了縱向血液樣本ctDNA存在與否與病理緩解情況的一致性。此外，分析了ESCC患者術後ctDNA預測術後復發的作用。
研究結果
ESCC患者治療前特徵和ctDNA檢測結果
隊列 A 包括18 例診斷為晚期食管癌的患者，2019年10月至2021年3月期間，這些患者接受了NAC+食管次全切除術。排除了血液樣本或原發灶活檢樣本不可及的患者。最終，隊列A分析了13例患者。隊列 B包括22例診斷為局部晚期食管癌的患者，2020年1月至2022年5月期間，這些患者接受了NAC+食管次全切除術。根據條件排除後，最終，隊列B分析了16例患者。表1總結了隊列A患者的基線臨床病理特徵。大多數患者為男性（77%），分別有3例（25%）、3例（25%）、2例（15%）和5例（39%）患者臨床分期為I期、II期、III期和IV期。9例患者可手術切除，包括1例鎖骨上LN轉移的IV期患者。其餘4例患者患有臨床T4b疾病或發生遠處轉移。如表2所示，手術結果，包括術後併發症，與先前報告的一致。
表1. 隊列A患者臨床病理特徵
表2. 手術結果
NAC前的ctDNA突變譜如圖1所示。在NAC前，4/6例（67%）臨床分期為I/II期的患者ctDNA呈陽性，所有III/IV期患者ctDNA均呈陽性。11例患者ctDNA突變陽性，包括11例（85%）患者檢出TP53突變，1例患者同時還檢出CDKN2A和NFE2L2突變。
圖1. 13例患者新輔助化療前的ctDNA突變譜和TP53變異丰度
NAC前後ctDNA狀態變化和治療療效
13例患者縱向ctDNA監測如圖2a所示。11/13例患者基線ctDNA陽性。4例患者被歸為緩解者：P01、P02和P03被歸為pGrade2（超過三分之二的腫瘤壞死或纖維化改變），P04被歸為pGrade1b（三分之一到三分之二的腫瘤壞死或纖維化改變）。3/4例病理緩解者（P01，P02和P04）NAC後ctDNA轉為陰性。如圖2b所示，NAC後的ctDNA陽性率與病理緩解顯著相關（緩解者，25%; 未緩解者，100%; p=0.007）。ctDNA陽性或陰性預測緩解情況的靈敏度為1.00，特異性為0.75，假陽性率為0.25，假陰性率為0，準確性為0.91。影像學療效評估顯示，在NAC前有可測量病灶的5例患者中，NAC後，2例達到PR，3例SD。其餘8例患者沒有可測量病灶。此外，2/4例緩解者在NAC前有可測量病灶，NAC後，1例達到PR，另1例SD。4例ctDNA陽性患者術後血清SCC水平持續1個月在正常範圍內。
圖2. a 13例患者臨床時間線和縱向ctDNA監測；b 緩解者（pGrade 1b–3）和未緩解者（pGrade 0和pGrade 1a）ctDNA陽性率比較
可手術切除患者術後ctDNA狀態和復發
分析了隊列B的16例可切除患者術後1或3個月時的血液樣本。人口統計學特徵見表3。術後，6例患者ctDNA陽性，2例患者ctDNA陰性。在ctDNA陽性患者中，1例術後3個月死於肺炎，其餘患者術後1年內出現復發。如圖3所示，ctDNA陰性患者的1年RFS為90%，而ctDNA陽性患者為0%（p = 0.0008）。使用Cox比例風險模型，ctDNA陽性患者與陰性患者的風險比為16.9（95% CI：1.92–149.4）。基於觀測數據，風險比為16.9，事件總數為6，分布比為1：2，雙側顯著性水平為5%，logrank檢驗的統計功效為0.904，有一定的功效水平。
表3. MRD分析患者特徵
圖3. 術後ctDNA陽性和ctDNA陰性患者RFS Kaplan–Meier分析
術後ctDNA縱向評估及復發
2例術後1年內復發的患者進行了連續ctDNA評估。NAC前後內鏡圖像，復發時PET以及血清SCC水平連續趨勢如圖4所示。病例1（圖4a）：術後3個月，ctDNA呈陽性，血清SCC水平正常；術後8個月，PET顯示多處遠處轉移，血清SCC水平升高。病例2（圖4b）：術後1個月，ctDNA呈陽性，術後血清SCC水平保持正常；術後7個月，PET顯示復發。在這2例病例中，ctDNA陽性都先於PET-CT復發，平均早5.5個月。
圖4. 術後復發患者新輔助化療前後內鏡圖像、復發時PET圖像、手術前後ctDNA丰度動態、血清鱗狀細胞癌抗原水平
討 論
本研究表明，局部晚期ESCC患者臨床病程中ctDNA縱向監測能夠反映腫瘤負荷變化。基於這些結果，ctDNA是潛在的術前NAC療效預測標誌物。此外，術後ctDNA與術後復發密切相關，提示根治性手術後ctDNA反映MRD。據我們所知，本研究首次表明了在接受NAC+手術的可切除ESCC患者病程中，ctDNA監測腫瘤負荷的臨床價值。這對於輔助治療和器官保留方案的選擇具有重要意義，這類患者無需手術切除即可治癒。
當ctDNA監測應用於腫瘤負荷低於轉移性疾病的可切除疾病時，血漿ctDNA檢出率受到關注。在本研究中，11/13例（85%）患者治療前ctDNA陽性，67%的I或II期患者呈陽性，儘管腫瘤為局限性。這些結果表明，本研究使用的panel能夠在較早期發現腫瘤信號。先前一項研究探索了食管腺癌的ctDNA水平，只有33%的I期或II期患者ctDNA呈陽性。本研究中ESCC患者的檢出率優於該研究中的腺癌患者，因此，即使是早期ESCC也可能適合ctDNA監測。此外，85%的患者中ctDNA檢出TP53基因突變。大約58-93%的ESCC患者cfDNA檢出TP53基因突變，與本研究結果一致。此外，基於可手術切除患者ctDNA檢出率相對較高，ctDNA監測適用於ESCC。先前的食管腺癌研究顯示，丰度（VAF）約為0.05-5.30%，本研究數據與其一致。此外，只有與原發灶突變相同的突變被定義為ctDNA，不包括意義未明的克隆性造血（CHIP）相關突變。
對於可手術切除的晚期ESCC，NAC後的ctDNA狀態反映了治療療效。換句話說，NAC後ctDNA陰性是NAC病理緩解的可靠指標。既往研究沒有分析ctDNA狀態與NAC病理緩解的一致性。本研究結果支持ctDNA檢測用於篩選術前病理緩解者。目前SANO試驗正在研究器官保留方案的安全性和有效性，在該試驗中，NACRT後臨床完全緩解的患者不進行手術，採用積極監測。然而，由於缺乏可靠的檢測方式，緩解者的診斷標準尚未標準化。雖然內鏡檢查可捕獲原發性腫瘤，但很難發現MRD。NAC後幾乎一半的殘留病灶位於粘膜下層或更深。因此，即使是活檢也無法準確檢測殘留疾病。鑒於ctDNA可以反映全身殘留疾病，而內鏡檢查可以檢測局部疾病，因此ESCC多學科治療聯合使用這些方法或能準確監測腫瘤負荷。
儘管既往也有研究納入了較多原發性腫瘤患者評估了ctDNA的效用，但臨床終點是腫瘤負荷降低程度，這可能不如病理緩解標準客觀。本研究發現，NAC後ctDNA與病理緩解存在顯著相關性，靈敏度和特異性高。本研究採用的是NGS而不是數字PCR，這種全面的方法有助於提高ctDNA評估準確性。關於預後，先前有研究在NAC期間監測ctDNA變化。然而，術後MRD評估更有效。術後ctDNA檢測結果明顯分層了術後復發風險。總體而言，ctDNA監測對於準確識別術前病理緩解者和預測術後預後很有價值。
關於RECIST標準與緩解者的相關性，RECIST不太通用，因為食管癌沒有可測量病灶。RECIST標準和緩解者並不總是匹配的，＜50%的患者有可測量病灶。此外，既往關於黑色素瘤的研究報告，使用ctDNA可以準確判斷PD和假PD，而影像學很難判斷，提示ctDNA在準確識別化療療效方面比影像學更有用。
在2例術後復發的患者中，血液ctDNA陽性比影像學發現腫瘤復發早約5.5個月出現。這與之前的一項研究相似，在該研究中，ESCC患者ctDNA水平升高比影像學提示復發提前約6個月。因此，ctDNA對於預測根治性食管切除術後的復發很有價值。最近，CheckMate 577試驗顯示，在接受NACRT+食管切除術的局部晚期食管癌患者中，免疫檢查點抑制劑納武利尤單抗輔助治療可以延長無病生存期。然而，由於免疫相關不良反應，可能會出現一些不可逆的毒性，術後納武利尤單抗輔助治療會造成經濟負擔。ctDNA監測可以準確評估術後復發風險，指導輔助治療的應用。
本研究有幾個局限。首先，樣本量相對較小。儘管需要開展更多更大型研究，但ctDNA和NAC療效的顯著相關性以及明顯的風險分層表明ctDNA是監測腫瘤負荷的有用標誌物，無論是NAC還是術後階段。作為補充，為了證明因果推理的穩健性，我們使用Schoenfeld方法，基於log-rank檢驗回顧性計算了統計功效。根據觀測數據，功效為0.904，有一定的功效水平。儘管由於患者數量少，HR置信區間範圍較大，但我們認為，本研究的功效是足夠的。其次，本研究採用了腫瘤知情方法來消除CHIP的影響。儘管DNA是從原發灶的幾個部位提取的，但由於腫瘤的異質性，幾個突變被忽略了。另一方面，在本研究中，需要連續血液樣本和原發灶活檢樣本，因此，如果有樣本無法獲取，很難進行分析。然而，如果能夠成功獲取樣本，分析成功率為100%。
總之，在接受NAC+手術治療的ESCC中，ctDNA可作為監測腫瘤負荷的潛在標誌物。開展更大隊列研究驗證這一結果，有助於ESCC基於ctDNA的個體化多學科治療。目前，我們正在準備一項多中心前瞻性研究，進一步驗證本研究結果。
參考文獻：
Morimoto Y, Matsuda S, Kawakubo H, Nakamura K, Kobayashi R, Hisaoka K, Okui J, Takeuchi M, Aimono E, Fukuda K, Nakamura R, Saya H, Nishihara H, Kitagawa Y. ASO Visual Abstract: Tumor Burden Monitoring with Circulating Tumor DNA During Treatment in Patients with Esophageal Squamous Cell Carcinoma. Ann Surg Oncol. 2023 Apr 5. doi: 10.1245/s10434-023-13391-w. Epub ahead of print. PMID: 37016011.