在轉移性結直腸癌（mCRC）中，異質性錯配修復（MMR）狀態可能與對免疫治療敏感性較低有關。天津醫科大學總醫院開展了一項研究，旨在探索mCRC原發灶和匹配轉移灶MMR狀態的一致性。研究納入了84例有原發灶和匹配轉移灶樣本的mCRC患者，使用免疫組化檢測原發灶和匹配轉移灶的MMR狀態。此外，對913例患者進行匯總分析，評估MMR狀態異質性的發生率和器官特異性。最後，分析MMR狀態異質性與臨床結局的相關性。研究發現，10例（11.9%）患者原發灶和匹配轉移灶的MMR狀態不一致。匯總分析顯示，原發灶MMR缺陷（dMMR）患者相比原發灶MMR正常（pMMR）患者，異質性MMR表型的發生率顯著較高（P<0.001）。在原發灶dMMR患者中，在肝、肺、卵巢、腹膜和遠處淋巴結轉移患者中觀察到異質性MMR狀態。而在原發灶pMMR患者中，僅在肝（26/440）或腹膜（7/112）轉移患者中觀察到異質性MMR狀態（P=0.02）。存在或不存在MMR狀態異質性的患者總生存期相似（P=0.452）。總體而言，一部分mCRC患者MMR狀態存在異質性，尤其是原發灶dMMR患者。檢測轉移灶可能很有價值，因為MMR狀態的不一致可能會影響免疫監視和免疫治療。
研究背景
結直腸癌（CRC）是第三大常見癌症，也是癌症相關死亡的第二大原因。在新診斷的CRC患者中，20%為轉移性患者，5年生存率<20%。15%的CRC患者的潛在致癌機制是錯配修復缺陷（dMMR），這通常與微衛星不穩定性（MSI）相關。在轉移性結直腸癌（mCRC）的治療中，檢測腫瘤DNA錯配修復（MMR）狀態已成為不可或缺的一部分，因為dMMR mCRC對免疫檢查點抑制劑（ICI）敏感。不幸的是，約30%的dMMR CRC對ICI原發耐藥，另外，相當一部分患者在初始獲益後繼發耐藥。免疫逃逸與WNT和JAK-STAT信號通路異常有關。此外，對ICI敏感性低與編碼抗原呈遞機製成分的基因突變有關。
影響ICI療效的另一個關鍵機制是腫瘤異質性。原發灶和相應轉移灶檢測揭示了基因變異的高度一致性，特別是致癌驅動基因變異。證據表明，與侵襲和轉移相關的基因變異發生在CRC早期階段，原發灶或轉移灶可用於檢測具有臨床意義的驅動基因變異。一小部分CRC表現出腫瘤內MMR狀態異質性，這可能會影響免疫監測。然而，MMR異質性的機制尚不清楚，是否會影響預後，需要進一步分析。發現匹配原發灶和轉移灶的MMR狀態存在差異可能對實施免疫治療構成挑戰。因此，本研究分析了mCRC原發灶和轉移灶MMR狀態的異質性，並進行匯總分析，探索MMR異質性的特徵。
研究結果
患者特徵
納入了183例診斷為mCRC的患者，這些患者於2016年1月至2020年1月在天津醫科大學總醫院普外科接受治療。排除了99例有新輔助放療和/或化療史，以及匹配樣本不足的患者。因此，納入了84例患者。轉移部位包括腹膜（n=28，31.8%）、肝（n=50，56.8%）、卵巢（n=4，4.6%）和肺（n=6，6.8%）。包括1例有3個轉移灶的患者和2例有2個轉移灶的患者。
MMR狀態的異質性
在原發灶中，9/84（10.7%）為dMMR（dMMR_PT），75/84（89.3%）為pMMR（pMMR_PT）。10/84（11.9%）例患者原發灶和轉移灶MMR狀態不一致。圖1A和C展示了患者4和16的MMR狀態異質性。對dMMR樣本及其匹配樣本進行MSI PCR分析。在dMMR樣本及其匹配樣本中驗證了MSI和MMR狀態的高度一致性。圖1B和D展示了患者4和16匹配樣本的MSI狀態。在dMMR_PT患者中，4例患者轉移灶MMR蛋白表達正常（pMMR_MT），5例患者轉移灶MMR蛋白表達缺失（dMMR_MT）。在pMMR_PT患者中，6例dMMR_MT，其餘69例pMMR_MT（圖2A）。5/28（17.9%）腹膜轉移患者和5/50（10%）肝轉移患者表現出MMR狀態的異質性。卵巢和肺轉移患者的MMR狀態沒有差異（圖2B）。有趣的是，2例患者原發灶和轉移灶dMMR，但匹配樣本MMR蛋白表達具有異質性。患者的臨床病理特徵見表1。
圖1. A，患者4 MMR-IHC檢測；B，患者4 MSI-PCR檢測；C，患者16 MMR-IHC檢測；D，患者16 MSI-PCR檢測
圖2. A，原發灶和轉移灶錯配修復（MMR）狀態圈圖。B，轉移部位與異質性MMR狀態相關性圈圖。C，匯總分析中原發灶和轉移灶MMR狀態圈圖。D，原發灶MMR缺陷（dMMR_PT）患者原發灶和匹配轉移灶MMR狀態的器官特異性圈圖。E，原發灶MMR正常（pMMR_PT）患者原發灶和匹配轉移灶MMR狀態的器官特異性圈圖。I表示pMMR_PT/dMMR_MT，II表示dMMR_PT/pMMR_MT，III表示dMMR_PT/dMMR_MT，MT表示轉移灶。
表1. 結直腸癌患者的臨床病理特徵及原發灶和轉移灶MMR蛋白表達狀態
本研究和文獻分析
dMMR mCRC患者數量相對較少，需要進行匯總分析來評估mCRC原發灶和轉移灶MMR狀態的相關性。該分析包括本研究和其他8項研究（表2）。Haraldsdottir的研究由於缺乏pMMR原發灶的數據，被排除在外。分析了900例患者中MMR狀態異質性的發生率。在原發灶pMMR患者中，761例患者（95.8%）轉移灶pMMR。在原發灶dMMR患者中，77例患者（72.6%）轉移灶dMMR。62例患者（6.9%）原發灶和轉移灶MMR狀態不一致（圖2C）。與原發灶pMMR患者相比，原發灶dMMR患者MMR狀態異質性發生率顯著更高（P<0.001）。接下來，分析了913例患者的組織，看MMR狀態的異質性是否與轉移部位有關。在原發灶dMMR患者中，在肝、肺、卵巢、腹膜和遠處淋巴結轉移患者中觀察到MMR狀態的差異（圖2D）。這種差異更可能見於卵巢轉移患者（4/4）（P<0.001）。相比之下，在原發灶pMMR患者中，MMR狀態的不一致更可能僅在肝（26/440）和腹膜（7/112）轉移患者中觀察到（P=0.02）（圖2E）。65例原發灶pMMR患者因轉移部位信息不可及被排除。
表2. 原發灶和匹配轉移灶MMR狀態文獻回顧
接下來分析MMR狀態異質性的器官特異性，發現腹膜轉移患者MMR狀態異質性的發生率最高（10.67%），而遠處淋巴結轉移患者發生率最低（0.93%）（P=0.016）（圖3A）。在所有轉移部位中，除遠處淋巴結外，原發灶dMMR患者的MMR狀態異質性發生率高於原發灶pMMR患者（圖3B）。
圖3. A，不同轉移部位患者中，原發灶和轉移灶錯配修復（MMR）狀態異質性發生率。B，不同轉移部位患者中，dMMR_PT患者或pMMR_PT患者MMR狀態異質性的發生率。C，異質性表達的MMR蛋白的頻率和比例。D，不同MMR蛋白異質性表達患者的頻率和比例。
為了探索MMR狀態異質性的機制，對異質性表達的MMR蛋白比例和異質性MMR狀態的患者比例進行了分類。在異質性表達的MMR蛋白中，MSH6和PMS2比例較高（圖3C）。MSH6或PMS2，MSH2/MSH6，MLH1/PMS2異質性表達的患者比例相對較高（圖3D）。
生存分析
生存分析評估了MMR狀態異質性與預後的相關性。原發灶pMMR患者的OS與原發灶dMMR患者相似 [風險比（HR）：0.86；95% CI：0.36-1.93，P=0.719）（圖4A）。原發灶pMMR患者中，轉移灶pMMR患者的OS與轉移灶dMMR患者相似（HR：2.02；95% CI：0.715.79，P=0.189）（圖4B）。原發灶和轉移灶MMR蛋白表達存在或不存在異質性的患者預後相似（HR：0.73；95% CI：0.33-1.56，P=0.452）（圖4C）。
圖4. A，原發灶dMMR與原發灶pMMR患者總生存期比較。B，原發灶pMMR患者中，轉移灶pMMR與dMMR患者總生存期比較。C，原發灶和轉移灶MMR蛋白表達存在或不存在異質性患者的總生存期比較。隊列Y，原發灶和轉移灶MMR蛋白表達存在異質性的患者；隊列N，原發灶和轉移灶MMR蛋白表達不存在異質性的患者。
討 論
ICI可延長dMMR/MSI-H mCRC患者的生存期。PD-1抑制劑在美國、瑞士和日本獲批用於MSI-H mCRC的一線治療。繼具有里程碑意義的 KEYNOTE-177研究結果之後，FDA批准帕博利珠單抗用於不可切除的 dMMR/MSI-H mCRC患者的一線治療。然而，約30%的dMMR CRC表現出原發耐藥，很大一部分在初始獲益後繼發耐藥。因此，對ICI耐藥是改善dMMR CRC治療的重大障礙。
有研究表明，腫瘤異質性是CRC對治療敏感性較低的關鍵機制。mCRC中KRAS突變的腫瘤內和腫瘤間異質性與抗EGFR治療耐藥或療效降低有關。然而，關於MSI/MMR狀態的時間和空間異質性的數據不足。為了填補這一空缺，本研究對匹配的原發灶和轉移灶進行了IHC和PCR分析，評估MMR狀態，揭示個體內MMR狀態異質性。發現11.9%的mCRC患者原發灶和轉移灶MMR狀態不一致，腹膜和肝轉移患者更可能存在MMR狀態異質性。
MMR狀態異質性發生率較低，需要進行匯總分析，結果顯示MMR狀態的總體一致性為93.1%。原發灶dMMR患者與原發灶pMMR患者的MMR狀態一致性分別為72.6%和95.8%。提示原發灶pMMR患者轉移灶dMMR的可能性很低。如果原發灶為dMMR，轉移灶分析可能很有價值，因為轉移灶MMR狀態不一致可能與原發性或獲得性ICI耐藥有關。
所謂的種子因素是腫瘤進展和轉移所必需的，dMMR原發灶的匹配轉移灶表現出一定程度的MMR狀態不一致。例如，存在於34%的MSI CRC和6%的MSS CRC的BRAF突變，與腹膜轉移密切相關。器官的微環境以及轉移環境是定植和轉移生長所必需的。轉移模式可能與異質性MMR狀態有關。因此，轉移在MSI發展之前就存在差異，因為惡性細胞的祖細胞在轉移播種之前並不攜帶原發腫瘤存在的所有突變，這些不一致的轉移灶腫瘤突變負荷較低。然而，潛在的MMR狀態異質性的原因尚不清楚。
散發性CRC或林奇綜合徵患者可能具有dMMR/MSI表型。與MLH1基因啟動子高甲基化相關的MLH1表達缺失是散發病例的最常見原因。在林奇綜合徵患者中，胚系突變多發生於MLH1或MSH2（90%）。相比之下，約10%的病例攜帶MSH6和PMS2突變。然而，本研究顯示，在異質性表達的蛋白中，MSH6和PMS2比例較高。此外，MSH6或PMS2異質性表達以及MSH2/MSH6和MLH1/PMS2異質性表達的患者比例較高。本研究探索了原發灶和匹配轉移灶MMR蛋白的異質性表達，據我們所知，是這方面最大的研究。
需要進行前瞻性試驗來確定MMR異質性對預後和治療效果的影響。本研究發現，存在或不存在MMR狀態異質性的患者OS率相當。不幸的是，本研究納入的患者沒有接受免疫治療，患者數量有限。ICI對異質性dMMR狀態的mCRC患者的療效如何，需要開展更大型的研究。此外，沒有有助於深入了解腫瘤進展過程中MMR狀態動態演變的數據，特別是在免疫治療選擇壓力下。
儘管本研究系統地評估了mCRC患者MMR狀態的個體內異質性，但存在局限性。例如，儘管IHC和PCR分析耗時更少，成本更低，但更先進的技術可能會產生更準確的結果。如NGS檢測可以實現更全面的分析。此外，由於mCRC中MMR狀態異質性的發生率低，缺乏相關研究，本研究的結果可能有些偏倚。
參考文獻：
Huang Q, Yu T, Li L, Zhang Q, Zhang S, Li B, Li X, Xiao W, Liu G. Intraindividual Tumor Heterogeneity of Mismatch Repair Status in Metastatic Colorectal Cancer. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2023 Feb 1;31(2):84-93. doi: 10.1097/PAI.0000000000001089. Epub 2022 Nov 22. PMID: 36409630; PMCID: PMC9928560.