BRAF非V600突變是結直腸癌（CRC）的一個獨特分子亞群，與BRAF V600突變幾乎沒有臨床相似性。目前普遍認為BRAF非V600突變與CRC患者較好的生存率相關。本文報道了1例初診為IIIC期結腸癌中年女性患者，在根治性手術後25個月發現多發轉移。下一代測序（NGS）結果顯示BRAF p.N581I（c.1742A>T）突變。患者接受了化療、靶向治療和免疫治療。然而，疾病進展迅速，伴罕見的骨和小腦轉移。該病例強調了BRAF非V600突變（如BRAF p.N581I突變），可能導致對表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑的耐藥，加快CRC患者病程。BRAF p.N581I突變在CRC中的作用有待進一步研究。
背 景
結直腸癌（CRC）是全球第三大癌症，轉移病變是其主要死亡原因。CRC可根據其分子特徵分為不同的亞型。其中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的激活是參與CRC發生的重要通路之一，主要包括Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）、V-RAF鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1（BRAF）、絲裂原活化蛋白（MEK）等。約10%的CRC患者發生BRAF突變，其中大多數均為V600E突變，即第15外顯子T1799A突變。攜帶BRAF非V600突變的患者數量較少，限制了對其進一步的了解。BRAF非V600突變的臨床關聯、基因相互作用和治療意義尚未得到深入研究。本文報告了1例轉移性結腸癌女性患者，該患者攜帶體細胞BRAF p.N581I突變，對EGFR抑制劑聯合化療耐藥，導致疾病快速進展。這種快速進展超出了既往對BRAF非V600突變研究的認知範圍。本文就BRAF非V600突變在CRC中的研究現狀進行討論。
病 例
患者女，41歲，因腹痛、腹脹伴肛門止便、排氣5天，於2018年11月27日到蘇州市立醫院腫瘤科就診。腹部增強計算機斷層掃描（CT）顯示結腸擴張、積液和氣液平，考慮腸梗阻的可能性（圖1A，B）。電子結腸鏡檢查顯示結腸內有一個菜花狀腫塊，位於距肛緣約70 cm處（圖1C）。病變完全阻塞腸腔，內鏡無法通過。快速病理檢查顯示腺癌。癌胚抗原（CEA） 15.77 ng/mol。患者於2018年12月24日接受乙狀結腸腫瘤全切除術。術後病理顯示為低分化腺癌（pT4aN2M0，圖2A）。腫瘤直徑約為4 cm。腫瘤浸潤整個腸壁，漿膜外纖維脂肪組織堆積。同時發現8個腸系膜淋巴結轉移。免疫組織化學（IHC）檢測結果如下（圖2B）：微衛星穩定/錯配修復完整（MSS/pMMR）、MLH1（+）、MSH2（+）、MSH6（+）、PSM2（+）、KI67（60%）、CDX2（+）、ER（−）和波形蛋白（−）。從2018年12月12日至2019年4月10日患者進行了6個周期的輔助化療（XELOX：奧沙利鉑，130 mg/m²，第1天；卡培他濱，1000mg /m²，每日2次，第1-14天，口服）。術後輔助化療後，患者在門診隨訪，每6個月進行複查CT掃描。體格檢查及生命體徵均在正常範圍1年余。最後一次結腸鏡檢查是在2020年8月進行的，也未發現異常（圖3A）。
圖1（A， B）患者術前CT掃描圖像（2018.11）。腹部增強CT掃描顯示結腸擴張和氣液平。（C）電子結腸鏡檢查提示結腸有一個大菜花狀腫塊，位於距肛緣約70cm處。病變完全阻塞了結腸腔。
圖2 結腸腫瘤組織標本進行蘇木精-伊紅染色（H&E）和IHC染色。（A）活檢結果為低分化腺癌，部分為黏液腺癌。（B）腫瘤向外纖維脂肪組織浸潤整個腸壁。
圖3 姑息治療過程中影像學CT成像顯示轉移性病灶。（A）結腸鏡檢查未發現異常（2020.08）。（B）術後2年以後影像學檢查（2021.02）。肝臟多發轉移灶。（C）PD-L1 IHC提示PD-L1表達為2%。（D）FOLFIRI聯合西妥昔單抗治療4個周期後，CT掃描顯示肝轉移灶明顯增大（2021.04）。（E）FOLFIRI聯合貝伐珠單抗治療5個周期後，複查顱腦MRI掃描顯示右側顱骨新發異常高密度影，考慮轉移（2021.06）。（F， G）mFOLFOX6聯合姑息性放療治療2個月後，CT顯示肝臟轉移灶與既往相似，顱腦MRI提示小腦轉移（2021.09）。（H）患者末次複查CT顯示肝轉移再次進展（2021.12）。
2021年2月複查腹部CT提示多發肝轉移，腎上腺也有轉移，伴腹膜後淋巴結腫大（圖3B）。CT評估為疾病進展（PD）。患者接受FOLFIRI一線姑息化療（伊立替康240 mg第1天，亞葉酸鈣500 mg第1天，5-氟尿嘧啶500 mg第1天靜脈推注，之後3000 mg 46h靜脈持續輸注，每2周1次）。使用2021年2月採集的福馬林固定石蠟包埋（FFPE）和血液循環腫瘤DNA（ctDNA）進行NGS分析。FFPE樣本中檢測到的基因突變和突變丰度如下：TP53p.E298*（37.52%）、APC p.Q1429*（33.35%）、RAF1p.R391W（23.56%）、BRAFp.N581I（22.65%）、KMT2C p.N2587*fs*1（19.82%）、EphA5p.R896H（12.65%）、B2Mp.M1T（4.47%）和MYC基因拷貝數增加（n=3.61）。外周血ctDNA樣本中檢測的基因突變和突變丰度如下：TP53p.E298*（27.58%）、APCp.Q1429*（45.95%）、RAF1p.R391W（25.58%）、BRAFp.N581I（22.15%）、KMT2C p.N2587*fs*1（18.13%）和STK11拷貝數丟失（n=1.1）。NRAS/KRAS基因均為野生型。詳細測序結果見表S1。PD-L1表達為2%（CPS，圖3C）。因此，在治療方案中加入西妥昔單抗（800 mg）。4個周期後，由於肝轉移灶增大，根據RECIST 1.1版，影像學評估顯示PD（圖3D）。患者於2021年4月接受FOLFIRI +貝伐珠單抗二線治療（伊立替康240 mg第1天，亞葉酸鈣500 mg第1天，5-氟尿嘧啶500 mg第1天靜脈推注，之後3000 mg 46h靜脈持續輸注，每2周1次，貝伐珠單抗300 mg第1天，每2周1次）。5個周期後磁共振成像（MRI）顯示顱骨內出現新的轉移灶（圖3E）。
表S1 FFPE及ctDNA NGS檢測結果。
因治療失敗，於2021年6月改用mFOLFOX6方案（奧沙利鉑120 mg第1天，亞葉酸鈣500 mg第1天，5-氟尿嘧啶500 mg第1天靜脈推注，之後3000 mg 46h靜脈持續輸注，每2周1次），並繼續原劑量貝伐珠單抗治療。期間患者因骨轉移接受了短療程姑息性放療（30 Gy，10次）和雙膦酸鹽（唑來膦酸）治療。患者出現皮質醇升高、高血壓等不良反應，經用藥後均好轉。2個月後，肝轉移似乎沒有明顯增加，但隨訪MRI顯示小腦轉移灶（圖3F，G）。患者隨後接受了4個周期的瑞戈非尼（80 mg）聯合信迪利單抗（200 mg）治療。患者於2021年11月25日接受最後一次治療，後因肝功能異常暫停治療。2021年12月21日，患者最後一次在我院的腹部CT檢查顯示，肝臟病變再次增大（圖3H）。此後，患者再未返回醫院。圖4顯示了患者的病程。
圖4 患者的病程
討 論
在轉移性CRC（mCRC）中，BRAF V600突變的發生率為5%-9%，而BRAF非V600突變估計僅為1-2%。BRAF突變可基於信號通路機制和激酶活性分為三類。1類BRAF突變為非RAS依賴型單體，具有高BRAF激酶活性，涉及密碼子600（如p.V600E/K/D/R/M等）。2類BRAF突變為非RAS依賴型二聚體，具有中等或高BRAF激酶活性，涉及600以外的密碼子（如p.K601E/N/Q、p.L597Q/R/S、p.G469A/R/V和p.G464A/R/V）。1類和2類BRAF突變在很大程度上獨立於其上游調節因子RAS GTPase，以促進腫瘤的生長和增殖。3類為RAS依賴型二聚體，BRAF激酶活性受損（如p.G466A/E/R/V、p.N581I/K/S/Y、p.D594A/E/G/H/N/V和p.G596R/C等）。其比野生型BRAF與RAS-GTP結合更緊密，導致ERK信號傳導增加。
BRAF非V600突變型CRC患者的臨床特點主要為：常見於男性、年輕、分化良好、淋巴結陰性、左半結腸，很少出現高度微衛星不穩定性/錯配修復缺陷（MSI-H/dMMR）。觀察到BRAF V600和非V600突變型mCRC患者的預後不同，BRAF非V600突變型患者的中位OS（mOS）明顯較長，為60.7個月，BRAF V600突變型患者為11.4個月，BRAF野生型患者為43.0個月。生存差異表明BRAF非V600突變型mCRC的侵襲性行為較低。據報道，BRAF突變1-3類和BRAF野生型的mOS分別為21.0個月、23.4個月、44.5個月和42.2個月。與3類患者相比，1類和2類BRAF突變型mCRC患者預後較差。3類BRAF突變（如BRAF p.N581I）的預後往往優於BRAF野生型。然而，本文患者在初診時已發生淋巴結轉移，隨後發生包括骨在內的大量轉移。OS大約為10.0個月，這比既往報告要短得多。
鑒於目前的研究發現，攜帶3類突變的CRC患者具有總體惰性病程，因此考慮其可能不需要積極的化療方案（對V600E突變型CRC有益）。目前的RAF抑制劑不太可能在2類或3類突變型CRC中抑制ERK信號傳導，因為RAF抑制劑可有效抑制突變單體，但不能抑制二聚體。Yaeger等人開展了一項納入28例3類BRAF突變患者的回顧性多中心研究，並觀察了抗EGFR治療的療效。9例攜帶3類BRAF突變的mCRC患者中有7例在一線或二線治療中對含有抗EGFR治療有應答，客觀緩解率（ORR）為78%。在三線或後期治療線中，37%的3類BRAF突變型mCRC患者達到緩解。1例攜帶BRAF p.N581I突變的患者在一線使用伊立替康和西妥昔單抗聯合治療後被評估為疾病穩定（SD）。無進展生存期（PFS）超過10.3個月。1例攜帶BRAF p.N581S突變患者在一線接受FOLFIRI和帕尼單抗聯合治療後達到部分緩解（PR），PFS接近達到16.0個月。同樣，一線接受FOLFOX聯合帕尼單抗治療的1例BRAF p.N581T突變患者被評估為PR。因此，這些數據表明化療聯合抗EGFR治療似乎對攜帶這些突變人群取得了良好效果，尤其是在一線治療中。然而，本文報道的病例與既往研究結果並不一致。患者在使用西妥昔單抗聯合FOLFIRI一線治療後疾病進展。病程進展迅速，PFS不超過3.0個月。
事實上，3類BRAF突變需要在上游進行二次打擊，這可能是RAS突變或EGFR激活。在CRC和肺腺癌中，3類BRAF突變體上游RAS激活的主要機制是受體酪氨酸激酶（RTK）的激活，而在黑色素瘤中則是RAS或NF1變異。因此，阻斷上游RAS信號傳導是3類BRAF突變CRC患者的潛在治療策略。基於3類BRAF突變依賴於上游EGFR信號傳導，本文患者應該對抗EGFR治療有應答。BRAF p.N581I突變和其他3類BRAF突變對EGFR抑制劑耐藥的原因，在很大程度上是由於這些BRAF突變依賴於RAS，每個上游RAS信號激活都會導致這些突變對抗EGFR治療產生耐藥性。
該患者在一線治療失敗後，在後續治療中出現多重耐藥。在二線治療中，選擇靶向血管內皮生長因子受體（VEGFR）的貝伐珠單抗聯合mFOLFOX6化療。然而，患者並未從中獲益，PFS仍然<3.0個月。根據REGONIVO研究，MSS轉移性CRC患者在標準化療後疾病進展，使用納武利尤單抗聯合瑞戈非尼治療後，ORR為33%，中位PFS為7.9個月。因此本文患者使用信迪利單抗聯合瑞戈非尼作為後期治療選擇。然而，即使多靶點抑制劑瑞戈非尼（靶向BRAF、VEGFR1-3、v-kit Hardy-Zuckerman4 貓科肉瘤病毒致癌基因同源物（KIT）和血小板衍生生長因子受體β（PDGFRB）等多個靶點），也未能控制患者疾病進展，未能增強免疫治療的效果。患者OS僅約為10.0個月。這種低存活率表明BRAF p.N581I突變的惡性程度非常高。
EphA5屬於RTKs家族，參與RAS-MAPK信號通路。EphA5突變可能激活RAS導致對EGFR抑制劑耐藥。患者FFPE的NGS分析顯示EphA5 p.R896H突變，可能導致RAS-GTP水平升高，MAPK信號通路擴增，參與多重耐藥。據報道，抗EGFR治療對患者這種為黏液腺癌的病理類型的臨床益處逐漸減少，也導致西妥昔單抗治療失敗。從ctDNA樣本中檢測出STK11拷貝數丟失。在BRAF p.N581I突變的背景下，其可能激活PI3K通路，正如在BRAF p.V600E突變的黑色素瘤細胞中發現的那樣。
可考慮使用MEK/ERK抑制劑聯合治療。1例攜帶BRAF p.N581S突變的肺癌患者對抗EGFR治療具有耐藥性，改用達拉非尼聯合曲美替尼治療後，PR維持超過33個月。此外，一項I期多中心試驗報告了BRAF非V600突變患者使用ERK1/2抑制劑Ulixertinib（優立替尼）（BVD- 523）後，腫瘤體積縮小。該試驗顯示了在NRAS/BRAF V600/非V600突變的惡性實體瘤中具有活性的早期證據。然而，未來還需要更多的驗證。
總之，本文報告了1例攜帶BRAF p.N581I突變型mCRC患者的罕見病例。患者對抗EGFR治療、抗VEGFR治療及常規化療均有耐藥，與既往對3類BRAF突變的治療認知不一致。快速進展和大量轉移表明，不能簡單地將3類BRAF突變視為預後良好的類型，全面的基因譜分析對於癌症治療至關重要。BRAF不同位點的突變可能對蛋白質功能產生不同的影響，了解與特定突變相關的功能變化對於選擇適當的治療策略極其重要。隨著NGS技術在臨床的廣泛應用，越來越多的罕見突變將被檢出。希望本文分享的臨床經驗對類似患者有益，對個體化治療決策有所幫助。本病例的不足之處在於未進行實時NGS分析，導致患者PD的ctDNA信息不明確。可能還有其他基因突變導致了隨後的耐藥及骨和小腦的遠處轉移。
參考文獻：Wang X, Zhao C, Gong Y, Wang Y and Guo F (2023) Multidrug resistance in the standardized treatment of colon cancer harboring a rare fibrosarcoma B-type (BRAF) p.N581I mutation: a case report. Front. Oncol. 13:1175693. doi: 10.3389/fonc.2023.1175693