缺乏CDK4/6抑制劑的預後和預測生物標誌物。接受這類治療的患者可進行循環腫瘤DNA（ctDNA）分析，ctDNA的動態變化可能是治療療效的早期預測指標。PEARL試驗比較了哌柏西利+氟維司群與卡培他濱，本研究對該試驗中的患者進行了血漿ctDNA分析，探索基線基因圖譜和治療期間ctDNA動力學與治療療效的相關性。在基線（C1D1）和治療期間（C1D15）收集相關血液樣本，對血漿ctDNA進行測序。使用單變量和多變量Cox模型分析ctDNA突變與治療療效的相關性。在治療期間ctDNA動力學模型中，使用預先指定的方法來評估C1D1和C1D15克隆突變的ctDNA變化。201例患者進行了基線樣本分析，ctDNA陽性與較差的PFS/OS相關。在兩個治療組中，TP53突變陽性均與較差的PFS和OS相關，在基線ctDNA陽性患者中也是如此。在總體人群中，ESR1突變與較差的OS相關，在基線ctDNA陽性患者中，不存在該相關性。僅在哌柏西利+氟維司群組中，PIK3CA突變與較差的OS相關。ctDNA動力學分析（n=120）顯示卡培他濱組的ctDNA抑制較高。在兩個治療組中，沒有ctDNA抑制的患者PFS均較差。本研究表明，攜帶血漿TP53突變的HR+/HER2- MBC患者生存狀況較差，無論接受內分泌治療還是化療。早期ctDNA抑制或可預測治療療效。需要進一步驗證ctDNA動力學的臨床效用。
研究背景
細胞周期蛋白依賴性激酶4/6抑制劑（CDK4/6i）聯合內分泌治療（ET）是激素受體陽性（HR+）、人表皮生長因子受體2陰性 （HER2-） 轉移性乳腺癌（MBC）患者的主要治療方案，可用於內分泌敏感和耐藥人群。然而，最初未比較該聯合療法與標準治療選擇化療在經治患者中的療效。GEICAM/2013-02 PEARL研究（NCT02028507）是一項多中心隨機3期臨床試驗，招募了芳香化酶抑制劑（AI）耐藥的HR+/HER2- MBC患者。總體而言，該試驗得出結論，在AI耐藥患者中，哌柏西利+ET沒有優於卡培他濱，CDK4/6i的安全性高於卡培他濱，支持CDK4/6i應考慮用於HR+/HER2- MBC患者的一線治療，但需要深入研究預後和預測生物標誌物，以更好地篩選潛在的治療獲益人群。
在PALOMA-3試驗中，患者被隨機分配接受哌柏西利+氟維司群或安慰劑+氟維司群治療，進行血漿ctDNA分析，發現高ctDNA分數、TP53突變和FGFR1擴增與預後較差相關，無論治療方案如何。臨床情況與PEARL入組患者相似的患者中，MBC中其他重要的基因如PIK3CA和ESR1突變對CDK4/6i治療決策沒有顯示出臨床意義。
有研究提出，治療壓力導致的ctDNA動態變化可早期預測治療療效。幾項研究分析了接受CDK4/6i聯合治療的患者，發現治療期間高水平的ctDNA是不良預後標誌物，預測較差的無進展生存期（PFS），儘管這些研究使用了不同的技術和ctDNA變化計算方式，方法未標準化。一項探索性研究納入了少量接受不同靶向治療的MBC患者，旨在比較各種策略來確定最優的預測閾值，提出了一種最佳方法，需在更大的隊列中進一步探索。
本研究對PEARL試驗隊列2中的患者進行了血漿ctDNA分析，收集基線（C1D1）和治療期間（C1D15）血液樣本，探索基線基因圖譜和治療期間血漿ctDNA動力學與療效的相關性。流程如圖1所示。
圖1. 研究流程
研究結果
人口統計分析
201例有基線樣本的患者納入預後分析，其中107例（53%）接受哌柏西利+氟維司群治療，94例（47%）接受卡培他濱治療。本研究人群與總體PEARL人群的基線特徵沒有差異。對經典人口統計學特徵的分析顯示，兩組患者沒有顯著差異，除了卡培他濱組有多個轉移部位的患者較多（76.6% vs 59.81%；p=0.02），但兩組內臟與非內臟疾病沒有差異。類似地，兩組的PFS沒有顯著差異（中位PFS [mPFS] 7.82 vs 9.26個月[m]；HR 0.97，CI95% 0.7-1.35，p=0.86，校正後p=0.96）。探索性OS分析也顯示兩組無顯著差異（中位OS[mOS] 23.95 vs 30.03m；HR 1.24，CI95% 0.74-2.06，p=0.41，校正後p=0.45）。
基線ctDNA突變與預後
在201例患者中，146例（73%）基線樣本至少檢出一個突變（ctDNA陽性），55例（27%）未檢測到任何突變（ctDNA陰性）。兩個治療組的基線基因圖譜沒有差異，均ESR1、PIK3CA和TP53基因突變頻率最高（圖2A）。ctDNA陽性患者的PFS顯著短於ctDNA陰性患者（mPFS 7.23m vs 14.75m；HR 1.85，CI95% 1.24-2.76，p<0.01）（圖2B）。ctDNA陽性患者的OS也顯著短於ctDNA陰性患者（mOS 23.26m vs 未達到；HR 5.22，CI95% 2.08-13.08，p<0.01）（圖2C）。
圖2. ctDNA突變分布，以及ctDNA狀態對PFS、OS的影響
基線ctDNA TP53、ESR1、PIK3CA突變與PFS
在總體人群中，有TP53突變患者的PFS短於無TP53突變患者，mPFS分別為4.4m和10.9m（HR 1.84；95%CI 1.28-2.63；p<0.01；校正後p<0.01）（圖3A）。此外，有一個以上、一個、無TP53突變的患者mPFS分別為3.55m、5.26m和10.91m，與無TP53突變的患者相比，有一個以上TP53突變的患者HR為1.98（CI95% 0.8-4.9），有一個TP53突變的患者HR為1.82（CI95% 1.25-2.64）（p<0.01；校正後p=0.02）（圖3B），提示有一個以上TP53突變的患者進展風險高於有一個TP53突變的患者。在哌柏西利+氟維司群組中，有TP53突變的患者PFS短於無TP53突變的患者（mPFS 4.83 vs 10.18m；HR 1.74，CI95% 1.08-2.78，p=0.03；校正後p=0.06）（圖3C）。在卡培他濱組中，有TP53突變的患者PFS也短於無TP53突變的患者（mPFS 3.78 vs 11.99m；HR 2.07，CI95% 1.17-3.67，p=0.02；p<0.05）（圖3D）。當分別分析哌柏西利+氟維司群組或卡培他濱組時，多個vs一個vs無TP53突變的患者PFS也從短到長，但數量有限。
圖3. TP53突變對PFS的影響
由於先前研究發現ctDNA陽性患者的PFS顯著差於ctDNA陰性患者，ctDNA陽性視為更高的腫瘤負荷和更具侵略性的生物學的替代物，是潛在的混雜變量，因此去除ctDNA陰性患者，重複分析。在ctDNA陽性患者中，有TP53突變的患者PFS也短於無TP53突變的患者，mPFS分別為4.4和9.26個月（HR 1.48；95%CI 1-2.17；p=0.05；校正後p = 0.10）。
ESR1或PIK3CA突變狀態不同的患者PFS沒有顯著差異，在總體人群和ctDNA陽性人群中均是如此。
基線ctDNA TP53與OS
有TP53突變的患者OS短於無TP53突變的患者，mOS分別為16.13m和30.03m（HR 2.89；95%CI 1.74-4.81；p = 0.0001；校正後p = 0.0004）（圖4A）。與無TP53突變患者（mOS 30.03m）相比，攜帶一個以上TP53突變的患者OS（mOS 13.47m）短於、風險比（HR 4.79，CI95% 1.43-16.04）高於只有一個TP53突變的患者（mOS 21.42m；HR 2.76，CI95% 1.64-4.67）（p<0.001；校正後p = 0.001）（圖4B）。單獨分析接受哌柏西利+氟維司群治療的患者（15.61m vs 未達到；HR 2.81，CI95% 1.44-5.49，p<0.01；校正後p=0.04）（圖4C）和接受卡培他濱治療的患者（22.08 vs 30.03m；HR 2.86， CI95% 1.29-6.38，p=0.01；校正後p=0.04）（圖4D），有TP53突變的患者OS也短於無TP53突變的患者。
圖4. TP53、ESR1、PIK3CA突變對OS的影響
由於ctDNA陽性對OS也有影響，在ctDNA陽性人群中重複OS分析。該分析證實，有TP53突變的患者OS短於無TP53突變的患者（mOS 16.13m vs 30.03m；HR 2.06；95% CI 1.21-3.5；p<0.01；校正後p=0.02）。此外，與無TP53突變的患者（mOS 30.03m）相比，攜帶一個以上TP53突變的患者OS短於、風險比高於（mOS 13.47m；HR 3.31，CI95% 0.98-11.19）只有一個突變的患者（mOS 21.42m；HR 1.97，CI95% 1.14-3.4）（p=0.02；校正後p=0.03）。
基線ctDNA ESR1、PIK3CA突變與OS
有ESR1突變的患者OS短於無ESR1突變的患者，mOS分別為21.78m和30.03m（HR 1.93；95%CI 1.16-3.2；p = 0.01；校正後p = 0.04）（圖4E）。按突變數量分層時，這一結果維持，與無ESR1突變的患者（mOS 30.03m）相比，有一個以上ESR1突變的患者OS短於、風險比高於（mOS 21.55m；HR 2.45，CI95% 1.27-4.72）只有一個突變的患者（mOS 24.61m；HR 1.67，CI95% 0.92-3.01）（p=0.02，校正後p=0.07）。單獨分析哌柏西利+氟維司群治療組（21.55m vs 24.77m；p=0.09，調整後p=0.11）或卡培他濱組（23.26m vs 30.03m；p=0.04，調整後p=0.13），有和無ESR1突變的患者OS差異不顯著。
在ctDNA陽性人群中，有和無ESR1突變的患者OS沒有差異（p=0.47；校正後p=0.99）。
在總體人群中，有PIK3CA突變的患者OS與無PIK3CA突變的患者相似（p = 0.14）。有趣的是，與TP53和ESR1不同，OS的差異似乎僅限於接受哌柏西利+氟維司群治療的患者，有和無PIK3CA突變的患者mOS分別為21.55m和24.61m（HR 2.47；95%CI 1.26-4.84；p=0.01；校正後p = 0.02）（圖4F），按突變數量分層時保持這一結果，與無PIK3CA突變的患者（mOS 24.61m）相比，有>1個PIK3CA突變的患者mOS 12.32m；HR 7.16，CI95% 2.78-18.47，有1個PIK3CA突變的患者mOS 21.78m；HR 1.74，CI95% 0.79-3.83（p<0.01，校正後p=0.03）。
在ctDNA陽性人群中，PIK3CA突變與OS無關（p=0.71，校正後p=0.75），但按治療方案分層時，PIK3CA突變與OS相關。
ctDNA動態分析的預測作用
120例患者符合標準，可以進行克隆突變（C1D1 VAF>0.5%）ctDNA動力學C1D15-C1D1 ctDNA比值（CDR）分析，哌柏西利+氟維司群組64例（53%），卡培他濱組56例（47%）。在總體基線人群中，81例（40%）患者未納入CDR分析，因為基線未檢測到ctDNA（n = 52；64%），基線突變VAF<0.5%（n = 14；17%），沒有配對的C1D15樣本（n = 14；17%）或C1D15樣本測序失敗（n = 1；1%）（圖1）。CDR分析患者的ECOG 1顯著高於非CDR分析患者，沒有其他臨床病理學差異。CDR和非CDR人群的生存存在顯著差異（mPFS 6.21m vs 14.75m），CDR人群的進展風險較高（HR 1.78，CI95% 1.25-2.52，p<0.001），與81%的非CDR人群基線ctDNA陰性或突變丰度低（VAF<0.5%）一致。CDR和非CDR人群的基因圖譜沒有差異。
CDR與PFS
兩個治療組的中位CDR存在顯著差異，卡培他濱組的CDR低於（即更深刻的ctDNA抑制）哌柏西利+氟維司群組（中位CDR 0.07 vs 0.21，p<0.01）（圖5A）。此外，卡培他濱組中CDR=0（即ctDNA完全抑制，低於檢測下限）的患者比例高於哌柏西利+氟維司群組（23.21% vs 7.81%，p=0.02）。
圖5. C1D15時縱向預測性ctDNA分析，使用中位CDR
然後，探索了最佳方法用於預測每組的PFS。在哌柏西利+氟維司群組中，最佳閾值為CDR=0.0247，HR為2.14（95%CI 0.92-5），p=0.06（圖5B）。在卡培他濱組中，最佳閾值為0.0127，HR為2.37（95%CI 0.96-5.83），p = 0.05（圖5C）。
儘管數量有限，分析了ctDNA抑制患者中TP53突變的潛在不利影響，顯示在兩組中，有和無TP53突變的患者生存沒有顯著差異，TP53突變、ctDNA抑制患者的生存總體上較好，提示實現早期ctDNA下降超過了基線TP53突變的不利影響（哌柏西利+氟維司群：mPFS 14.55 vs 16.53m；HR 1，95% CI 02-5；p=0.99；卡培他濱：mPFS 8.25 vs 16.66m；HR 2.71，95%CI 0.52-14.06；p=0.27）。
C1D1克隆突變的加權平均值是最佳的預測方法，在兩個治療組中均是如此。用於CDR計算和預測的其他方法總體上顯示出相似的結果，儘管不如最佳方法。
CDR與療效
在納入縱向預測ctDNA分析的120例患者中，118例療效數據可及。客觀緩解（OR）定義為完全緩解（CR）或部分緩解（PR），臨床獲益率（CBR）定義為OR和穩定疾病（SD）（根據RECIST v1.1），根據研究納入的所有患者的CDR值進行評估。OR為18%（均為PR），CBR為73.7%。疾病進展（PD）患者占26.3%。
總體而言，CBR患者（N = 87）的CDR抑制高於進展患者（N = 31），CDR分別為0.1和0.2（p = 0.03），但按治療方案分層時，不存在該差異（哌柏西利+氟維司群p=0.12，卡培他濱p=0.29），但樣本量有限。
討 論
本研究表明，很大一部分HR+/HER2-轉移性乳腺癌患者血漿檢測到TP53突變，與未檢測到TP53突變的患者相比，其結局顯著較差。在內分泌治療或化療組中，TP53突變患者生存均很差，擴展了PALOMA-3試驗中接受內分泌治療的患者的結果，提示侵襲性行為，與治療無關，突出了設計臨床策略以改善該人群結果的必要。我們認為TP53突變應該納入未來HR+/HER2- MBC的預後和預測模型，因為該有害因素可能影響很大，模型不納入該信息可能影響其適用性。此外，在我們的探索性OS分析中，TP53突變也導致OS較差。儘管在PEARL進展後，後續治療不受控制，但研究顯示，不同治療組的PFS2和OS沒有差異，提示與本研究中對OS影響的發現一致。有趣的是，我們發現多個TP53突變會帶來更差的結果，這一觀察結果需要進一步驗證。我們承認這些發現的潛在局限是，我們沒有對測序進行胚系校正，檢出的一些TP53突變可能是由克隆性造血引起的。鑒於TP53突變在乳腺癌中的高發生率，克隆性造血可能對我們的結論有一定的污染作用。但是，我們試圖採取一些措施來儘量減少這種影響。除了常規的質控外，根據變異群體頻率消除了已知的群體水平胚系變異。我們使用基於VAF的潛在胚系突變的自定義R腳本進一步對剩餘數據進行了分析和過濾，並且我們的分析中僅包括致癌/可能致癌變異。TP53突變存在於5-10%的CHIP，轉移性乳腺癌患者中ctDNA檢測到CHIP的比例最高約為25%。因此，在本研究中，只有1.25-2.5%的患者可能存在TP53 CHIP突變，其中大多數會被我們的分析方法過濾掉。因此，我們認為CHIP對我們結論的影響很小。我們承認胚系白細胞DNA測序有助於優化CHIP減法，但不幸的是，這在本研究中不可能。該人群中存在或獲得的其他常見突變，如ESR1或PIK3CA突變，在探索性OS分析中特別相關。發現ESR1突變導致生存較差，與先前的研究結果一致。此外，在接受哌柏西利和氟維司群治療的患者中，還發現PIK3CA突變對OS的不利影響。越來越多的證據表明，在轉移性乳腺癌中，PIK3CA突變似乎會帶來較差的結果，相比之下，在早期患者中，PIK3CA突變通常與較好的結局相關。與先前使用組織樣本的研究相比，本研究中ESR1突變患者比例略高，這可能反映了ctDNA可以有效檢測PIK3CA突變，PIK3CA突變通常是多克隆的，存在於亞克隆水平。
關於早期預測，我們應用了先前報告的15種方法來計算CDR，包括經治樣本中潛在的克隆基因的VAF的加權平均值。本研究顯示，在兩個治療組中，該方法均可以篩選出獲益較多的患者，先前的研究表明，早期ctDNA動力學或可預測療效，本研究提供了進一步證據。
我們承認，我們的CDR結果是探索性的，需要進一步驗證。我們的panel似乎僅限於廣泛探索ctDNA動力學，但我們的方法旨在評估相關突變的早期動力學，這些突變在患者的血液循環中具有足夠的代表性，其變化可以可靠地評估，這是其他類似研究中未完全解決的重要問題。我們也承認我們的方法的靈敏度可能不如腫瘤知情方法，但鑒於我們重點關注變化，我們認為關鍵點是突變丰度的可靠定量（即我們研究中的VAF），試圖通過關注相關基因和進行深度糾錯測序來實現這一點。我們的CDR結果有局限性，但我們試圖提供嚴格的數據。治療療效預測的最佳閾值在取決於背景，會因臨床環境、治療和用於評估ctDNA變化的算法而異。然而，有趣的是，使用我們的方法得出的PEARL最佳閾值與PALOMA-3和先前納入接受靶向治療的患者的研究一致，提示早期ctDNA抑制（通常為CDR處於0-0.1）很重要，可以篩選出獲益較多的患者。我們注意到，這可能不適用於接受免疫治療的患者，在接受免疫治療的患者中，較少的ctDNA抑制就可能足以篩選出治療反應較好的患者。我們假設，基於內分泌或化療的治療必須達到重要程度的細胞抑制或細胞毒性作用才能預測長期益處，而對於接受免疫治療的患者，微環境在控制增殖方面起著重要作用，較小的細胞抑制或細胞毒性作用，反映在較高的CDR，可能足以篩選出獲益較多的患者。
與哌柏西利和氟維司群相比，接受卡培他濱治療的患者第15天時ctDNA抑制明顯更顯著，提示化療細胞毒性可能導致更快的抑制。有趣的是，基線未檢出任何突變的患者生存顯著優於檢出突變的患者。這是意料之中的，進一步證明沒有檢出突變可能反映了低腫瘤負荷或增殖，因此預後較好，無論治療方案如何。
總之，本研究表明，攜帶血漿TP53突變的HR+/HER2- MBC患者PFS較差，無論接受內分泌治療或化療。此外，血漿ESR1突變的患者可能長期生存較差。本研究進一步證明了早期ctDNA抑制或可預測長期治療療效，提出了有助於選擇獲益較多患者的最佳方法。需要進一步驗證ctDNA動力學的臨床效用。
參考文獻：
Pascual J, Gil-Gil M, Proszek P, Zielinski C, Reay A, Ruiz-Borrego M, Cutts R, Ciruelos Gil EM, Feber A, Muñoz-Mateu M, Swift C, Bermejo B, Herranz J, Margeli Vila M, Antón A, Kahan Z, Csöszi T, Liu Y, Fernandez Garcia D, Garcia-Murillas I, Hubank M, Turner NC, Martín M. Baseline mutations and ctDNA dynamics as prognostic and predictive factors in ER-positive/HER2-negative metastatic breast cancer patients. Clin Cancer Res. 2023 Jul 25:CCR-23-0956. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-23-0956. Epub ahead of print. PMID: 37490393.