人類表皮生長因子受體2（HER2）基因，即ERBB2基因，是定位於人類17號染色體（Chr17）長臂（17q12）上的原癌基因。HER2基因發生擴增通常會導致HER2蛋白的過度表達。HER2基因擴增導致癌症具有高度侵襲性，是患者預後不良的重要指標，常發生於乳腺癌、胃癌、肺癌等癌症中。目前，曲妥珠單抗、帕妥珠單抗等抗HER2靶向藥物可以有效地治療HER2擴增的腫瘤患者。因此，準確評估HER2狀態對於腫瘤患者準確的預後和治療信息至關重要。
臨床上HER2擴增的檢測方法主要有免疫組化法（IHC）、螢光原位雜交法（FISH）等。不同的檢測方法、計算的準確性和試劑的選擇都會影響HER2的檢測結果。對於IHC評估為2+的結果，指南推薦需用FISH方法學確認。同樣，對於HER2 FISH結果，美國臨床腫瘤學會和美國病理學家學院（ASCO/CAP）2013版指南也分為陰性、陽性和不明確三大類。隨後ASCO/CAP 2018版指南解決2013版HER2 FISH檢測不明確的問題，將HER2 FISH擴增劃分為5個組別，分別評估[1]。
2018 ASCO/CAP指南標準針對HER2 FISH的結果判定
鑒於分子診斷技術的不斷進步，下一代測序（NGS）技術能夠同時檢測基因擴增和突變，進而對患者更好地分類管理。為探究在IHC評估HER2擴增不確定的樣本，用NGS分析的準確性，2021年發表在Histopathology（IF=5.087）上的一篇回顧性研究進行了分析[2]。
該研究搜集了紀念斯隆凱特琳癌症中心（MSKCC）自2009年1月1日至2019年9月30日期間，經IHC平台檢測ERBB2表達且結果不明確（2+或1+至2+）的浸潤性乳腺癌病例，回顧了同一組織樣本的FISH和NGS檢測（MSK-IMPACT）數據，分析比較三種平台的檢測結果。對於2018年ASCO/CAP指南之前檢測的病例，HER2 FISH結果依據指南重分為5組，並且對第2、3、4組樣本重新進行FISH檢測分析。NGS測序基於MSK-IMPACT產品檢測486個癌症相關基因不同突變類型。考慮到拷貝數檢測結果會受到腫瘤細胞占比等因素的影響，參考ROSS等人研究結論，將ERBB2基因擴增倍數≥2.0定義為基因擴增，將1.5≤擴增倍數≤2.0且P值＜0.05定義為拷貝數增加（靈敏度95%，特異性100%）[3]。
研究結果
研究分析了來自51名乳腺癌患者的52份FISH和NGS結果，所有患者HER2 IHC結果均為不確定。患者的臨床和病理結果見表1。參考2018年ASCO/CAP HER2檢測指南，對51名患者FISH結果重新分類，第1-5組的患者數目分別是：8例（15.4%）、3例（5.8%）、3例（5.8%）、14例（26.9%）和24例（46.2%）。患者初診年齡、病理分期等臨床因素均無顯著性差異。在對患者進行20.9個月的中位隨訪中，第4組的14名患者中有2名在最後一次臨床隨訪時去世，其餘健在。
表1.來自51例患者的52份樣本的乳腺癌臨床和病理特徵
ERBB2擴增狀態—NGS和FISH方法比較分析
針對NGS和FISH檢測ERBB2擴增結果（表2），第1組至第5組樣本中NGS檢出為ERBB2擴增/拷貝數增加的數目為：8例（8/8; 100%）、2例（2/3; 66.7%） ,1例（1/3; 33.3%）,1例（1/14；7.1%）和0例（0/24; 0%）。在這些樣本中，第1組5例NGS檢出ERBB2拷貝數增加，3例檢出擴增。第2組的2例分別檢出擴增和拷貝數增加。第3組1例檢出ERBB2擴增。第4組1例檢出ERBB2拷貝數增加（NGS、IHC、FISH檢測結果見圖1）。
表2.分析比較NGS和FISH方法學檢測ERBB2擴增結果
圖1
針對第4組樣本的分析（表3），在NGS檢出HER2未擴增的5例樣本中，對來自同一樣本（n=3）或不同樣本（n=2）的HER2 FISH檢測結果都歸類為第4組。有1例NGS結果為陰性的樣本的兩塊組織，FISH結果分別歸於第4組和第5組。然而，有1例患者FISH檢測原發灶樣本結果為第1組（陽性），NGS提示拷貝數增加，而之前歸類為第4組的標本來源是轉移性肝病灶，推測是由於腫瘤原發灶和轉移灶間的異質性導致。總體來說，FISH檢測為第4組的樣本與NGS檢測及新樣本檢測為陰性的結果高度一致。
第2組的3個樣本中，HER2 FISH結果來自於不同腫瘤樣本，2例歸類為第1組陽性，另1例樣本經NGS檢出未擴增而FISH結果一致分類為第5組陰性，且FISH結果與NGS結果一致。第3組的2個病例中，1例樣本NGS未檢出擴增且HER2 FISH 結果分類為第 5 組，檢測結果一致。而另1例患者，原發灶樣本通過NGS檢出擴增，而轉移灶經過FISH檢出結果分類為第5組陰性。根據原發灶FISH結果（第3組，陽性），患者接受了HER2靶向治療，但在多線化療後最終死於轉移性疾病。表明在經過重新檢測的樣本中，NGS和FISH兩種平台對患者ERBB2擴增狀態的一致性比較高。
NGS突變分析揭示拷貝數變化差異
NGS平台檢測範圍同時覆蓋了基因擴增和體細胞突變，圖2為第1、4和5組病例中檢出情況。與第4組相比，在單變量分析中，ERBB2基因擴增檢測結果與第1組的拷貝數變化顯著相關（p=0.01）。RARA基因擴增和第1組的拷貝數變化也存在顯著相關性（P=0.04）。研究表明，在第1組和第4組所有攜帶RARA基因擴增的5例樣本中，均伴隨ERBB2擴增。而在第4組和第5組的體細胞突變或拷貝數變化之間沒有顯著差異。
2018年ASCO/CAP第4組患者的HER2靶向治療
在第4組的14名乳腺癌患者中，4名（28.6%）患者接受了抗HER2靶向治療。其中1名患者為新輔助和輔助治療，該患者為35歲轉移性乳腺癌肝轉移患者，IHC結果為2+，肝臟病灶FISH驗證結果為HER2擴增，患者隨即接受了多西他賽、曲妥珠單抗和帕妥珠單抗等新輔助治療。值得注意的是，在本研究中對肝結節的同一組織樣本的HER2 FISH結果仍然歸類為第 4 組（HER2 /CEP17=1.6，平均HER2拷貝數為5.2）。患者隨後接受了乳房切除術，結果表明對新輔助化療反應極小。研究對乳腺術後病灶FISH檢測結果為第1組（HER2/CEP17=2.7，平均HER2拷貝數為5.5）。而對第4組其餘10名未接受HER2靶向治療的患者進行17個月的中位隨訪中，有9名（90.0%）在初始治療後保持無病生存。
ASCO/CAP ISH第1、4/5組的乳腺癌病例中，通過NGS檢出的體細胞突變和拷貝數改變。
總結討論
在這項針對HER2 IHC 結果不確定的浸潤性乳腺癌的回顧性單研究中，分析總結了基於2018年ASCO/CAP指南的FISH檢測結果與NGS技術檢測ERBB2拷貝數的相關性。研究發現，ASCO/CAP指南納入到第4組的14例樣本中有13例（92.9%）經FISH和NGS評估ERBB2為未擴增。另外1例患者的肝轉移病灶FISH檢測為未擴增，但NGS檢出ERBB2拷貝數增加；隨後對患者原發灶FISH檢測為HER2擴增，歸類為2018ASCO/CAP ISH第1組，與NGS結果一致。由於研究中FISH和NGS檢測樣本為相同的組織塊，所以腫瘤內異質性還不足以解釋結果不一致。這例不一致的HER2 FISH結果來源於樣本中低水平的擴增，導致NGS檢出ERBB2拷貝數增加，這可能是導致結果不一致的原因。這同時也說明了，針對HER2低水平擴增的樣本，FISH檢測結果的不確定性。
研究通過NGS檢出56%（5/9）的樣本同時發生ERBB2擴增與RARA擴增。而RARA基因在染色體上與ERBB2基因相鄰，表明兩者的擴增具有顯著關聯性。而且，前期有兩項研究中也分別在71%（5/7）和71%（10/14）的HER2擴增的樣本中檢出RARA擴增（FISH法）。同時，本研究發現ASCO/CAP指南標準分類的第1組和第4組之間，NGS檢出的ERBB2以及RARA基因的拷貝數變化存在顯著差異。因此，RARA基因擴增也可用作HER2 FISH結果不確定的替代檢出指標（ASCO/CAP指南暫未推薦）。
關於HER2靶向治療，研究顯示在第4組患者中，NGS檢出超過90%的患者經驗證為HER2未擴增，這些患者並未接受HER2靶向治療並且持續無病生存，而在少數接受抗HER2治療的第4組患者中，2例患者獲益1例患者疾病進展。所以2018年ASCO/CAP指南並不推薦歸類為第4組患者使用抗HER2靶向治療。
同Ross 等人研究結果一致，本研究結果支持將NGS作為FISH檢測HER2擴增的替代方案。事實上，與FISH方法學相比，NGS不僅可以準確檢測ERBB2擴增同時提供豐富的基因突變信息，具有更廣泛的指導意義，但受限於檢測周期較長。至於檢測結果，FISH技術因不同抗體間敏感性以及不同觀察者間判讀標準的差異性也影響著FISH的準確性。該研究雖然存在些許局限性，比如樣本量較少，回顧性而非前瞻性研究的限制及樣本選擇的不統一導致的異質性干擾，但針對於ASCO/CAP HER2 FISH第1、4和5組樣本的綜合分析，表明NGS測序對於IHC結果不確定的HER2檢測具有拷貝數評估客觀的優勢，還能夠準確地靶向治療獲益的患者。例如，NGS能夠檢出IHC和FISH都無法檢出的HER2擴增，當然這種情況比較罕見。而在常見的ASCO/CAP指南第4組乳腺癌患者中，NGS能夠將該組患者確認為HER2 FISH陰性，支持其從2013版指南中HER2 FISH不確定組重新分類為2018版HER2陰性，表明在評估乳腺癌患者HER2拷貝數時，採用NGS方法是可以輔助判定FISH /IHC檢測結果不明確的樣本，從而提高臨床診斷效率及臨床診斷準確性。
參考文獻：
[1] Wolff AC, Hammond MEH, Allison KH, Harvey BE, Mangu PB, Bartlett JMS, Bilous M, Ellis IO, Fitzgibbons P, Hanna W, Jenkins RB, Press MF, Spears PA, Vance GH, Viale G, McShane LM, Dowsett M. Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Clinical Practice Guideline Focused Update. J Clin Oncol. 2018 Jul 10;36(20):2105-2122.
[2] Hoda RS, Bowman AS, Zehir A, Razavi P, Brogi E, Ladanyi M, Arcila ME, Wen HY, Ross DS. Next-generation assessment of human epidermal growth factor receptor 2 gene (ERBB2) amplification status in invasive breast carcinoma: a focus on Group 4 by use of the 2018 American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists HER2 testing guideline. Histopathology. 2021 Mar;78(4):498-507.
[3] Otsuji K, Sasaki T, Tanabe M, Seto Y. Quantitative assessment of HER2 gene amplification of breast cancer using droplet digital PCR. Pathol Int. 2021 Aug;71(8):538-547.