每年胃癌（GC）新发病例超过100万，死亡病例约为76.9万。区分是复发转移性癌还是第二原发癌具有预后和治疗意义。传统诊断方法是对肿瘤组织样本进行组织病理学比较。然而，这种方法有局限性，包括判读主观性、肿瘤异质性以及可能影响诊断的肿瘤微环境变化。全面基因组分析（CGP）可以完善组织病理学分析结果，同时揭示潜在可治疗的基因变异。一些对ERBB2，MET，EGFR和FGFR2阳性的转移性GC患者进行靶向治疗的临床试验显示了不同的结果。未见显著益处的一个潜在原因是这些临床试验是根据原发肿瘤来制定治疗方案的。
本文描述了一例同时患有胃腺癌和原发灶未明的鳞状细胞癌（SCC）的患者。我们设想，尽管有不同的组织病理学诊断，患者可能是一个原发灶发生了转移，而不是存在两个不同的原发灶。我们对原发灶和转移灶样本进行了全外显子组测序，比较了检出的单核苷酸变异（SNV）图谱，发现来源于同一个克隆，显示了不同病灶间的异质性，这证实了我们的设想。我们认为，GC去分化在转移灶体现为SCC反映了患者高度的肿瘤内异质性（ITH），这可能导致免疫检查点抑制剂（ICI）耐药。
病 例
患者为一名56岁的亚裔女性，无既往病史，自己触摸发现左颈肿块。患者曾短暂居住美国境外，在那里接受了PET/CT检查，显示颈部、纵隔、腋窝、左胃区、肝总动脉和腹膜后淋巴结肿大，以及胃下部的不规则壁增厚并有壁外浸润。左颈淋巴结（LN）穿刺活检显示低分化癌，很可能是转移性SCC。双侧乳腺X光检查和乳腺超声检查显示没有明显病灶。食管胃十二指肠镜（EGD）检查发现胃中部有溃疡浸润性病灶。病理检查结果为中低分化腺癌。结肠镜检查发现良性息肉。
患者回到美国后，向我们报告了病史。体格检查中，触摸上腹部，有轻微痛感。实验室检查，包括全血细胞计数、癌胚抗原、CA19-9、CA125、CA15-3和甲胎蛋白结果均正常。腹部和骨盆CT显示肿块样胃壁增厚，上腹部广泛聚集性淋巴结病，腹膜癌伴少量恶性腹水。宫颈检查和巴氏涂片检查结果均正常，排除了宫颈SCC是转移性SCC的来源。无法从海外获得患者最初的活检样本。对一个腋窝肿大LN进行了重复活检。在开始治疗之前进行了用于生物标志物分析的EGD检查，确认胃体存在坏死肿块。病理学检查显示与具有粘液特征的中分化腺癌一致。生物标志物分析，包括PD-L1表达，显示综合阳性评分（CPS）为0。HER2/neu免疫组化（IHC）为阴性。DNA错配修复（MMR）蛋白PMS2表达缺失，MLH1表达部分缺失，MSH2和MSH6表达正常。腋窝LN活检显示转移性SCC。PD-L1肿瘤比例评分（TPS）为5%，PD-L1联合阳性评分（CPS）也为5，MMR IHC显示PMS2表达缺失，MLH1、MLH2和MSH6表达正常。腋窝LN和胃肿块均显示MMR蛋白PMS2缺失，表明两个肿瘤均存在微卫星高度不稳定性（MSI-H/dMMR）。由于组织学明显不同的肿瘤均为MSI-H，进行了胚系基因检测判断是否为林奇综合征，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2或EPCAM均未检测到胚系致病性突变。
考虑到肿瘤为MSI-H，开始进行FOLFOX和帕博利珠单抗治疗。对腺癌和SCC进行的全外显子组测序证实了MSI-H状态，检出了许多体细胞变异（表1）。尽管接受了近6周的化学免疫治疗，但患者摄食量依旧很少，患者接受了双j管放置术和诊断性腹腔镜检查。腹膜活检显示转移性SCC，PD-L1 CPS为5，MMR IHC显示PMS2缺失。患者重新开始治疗，但原发肿瘤出血。尝试姑息性切除，但由于原发肿瘤广泛累及血管系统而中止。考虑到目前为止患者经过3个月治疗没有获益，术中对大小弯淋巴结进行活检，以进一步进行生物标志物检测。来源于大弯的四个淋巴结转移癌阳性，其中一个淋巴结内同时存在粘液性腺癌和SCC形态（图1）。这些样本的MMR IHC显示PMS2表达缺失，PD-L1检测显示CPS为1。不幸的是，尽管接受了姑息性放疗和二线治疗，患者疾病继续进展，被转诊到临终关怀医院，1个月后去世。
表1. 五个样本中检出的体细胞变异
图1. 切除的淋巴结组织学检查显示存在相邻区域同时有腺癌和鳞状细胞癌
讨 论
据我们所知，很少有报道描述肿瘤内异质性可能导致免疫治疗耐药。本文描述了一例同时患有胃腺癌和原发灶未明的SCC的患者。我们设想，尽管有不同的组织病理学诊断，患者可能是一个原发灶发生了转移，而不是存在两个独立的原发灶。病程中，我们在三个时间点对患者的病灶进行了取样（图2）：（1）胃原发肿瘤和腋窝淋巴结，（2）治疗后腹膜转移灶，（3）进一步治疗后胃周淋巴结。对所有样本进行了全外显子组测序，显示转移性SCC和原发性胃腺癌之间存在类似的突变。切除的LN存在相邻区域同时有腺癌和SCC（图1）也显示了这一点。例如，所有组织样本均存在MSI-H以及胃腺癌和SCC（淋巴结和腹膜组织活检发现）共有的体细胞突变（表1）。我们对所有样本的SNV突变谱进行了更深入的配对比较，以分析肿瘤样本间的克隆性或基因变异独立性（表2）。TCGA泛癌数据库包含了11000多名患者的样本，覆盖66种不同的肿瘤类型。通过分析TCGA数据库，确定了至少一个样本中检测到的SNV突变频率。多重配对分析表明，所有五个样本均来源于同一个克隆（表2）。正如预期的那样，组织学相同的样本最可能来源于同一个克隆，但即使是组织学不同和取样时间点不同的样本，基因变异分析数据仍显著体现这一点。
图2. 胃肿瘤和右腋窝淋巴结治疗前活检（黑色）；治疗后腹膜活检（蓝色）；进一步治疗后胃周淋巴结活检（红色）
表2. 体细胞变异配对比较
ITH可能会导致免疫治疗耐药，本文患者可能就是这种情况。我们认为异质性的主要表现是原发灶腺癌去分化在转移灶体现为鳞状细胞癌。此外，在同一胃周LN内，存在同时有腺癌和SCC的区域（图2）。尽管对通常的起源部位进行了评估，但未确定SCC原发灶。我们认为，与两种原发性恶性肿瘤转移到同一淋巴结的假设相比，更可能是患者的转移灶起源于原发灶的克隆演化从而产生ITH。对帕博利珠单抗治疗有显著反应的MSI-H转移性GC患者进行了治疗后的活检，非同义突变与同义突变的比率（dN/dS比率）降低，突变克隆总量减少，证明了这一设想。与此相比，那些对治疗几乎没有反应的患者dN/dS比率仍然很高，表明突变亚克隆的进化适应性。Kwon等人在对治疗有反应和无反应的MSI-H患者中都观察到了基线ITH，但是发现有反应的患者异质性消失，表明依然存在ITH可能是免疫治疗耐药的原因。有趣的是，患者活检显示LN腺癌成分突变量最低，可能代表了某种混合反应，这种克隆消失（表2）。与此相比，LN样本中的SCC成分和之前治疗后的腹膜SCC依然存在大量突变，表明了耐药性和总体疾病进展。
此外，Wolf等人研究了黑色素瘤小鼠的ITH，表明不同的克隆造成了肿瘤和基因的多样性，不同克隆的数量决定着肿瘤的侵袭性和对ICI的反应。我们认为该患者存在高度的ITH，这可能导致免疫逃逸和对ICI缺乏反应。此外，尽管存在新抗原，高度的ITH可导致肿瘤克隆细胞数量低于某个阈值，不足以产生免疫反应。我们认为，尽管所有肿瘤样本均为MSI-H，且与组织学形态无关，高度异质性的肿瘤可能会稀释新抗原。
本文呈现的临床病例表明原发性肿瘤去分化导致ITH增高，这是我们通过全外显子组测序分析肿瘤克隆特征发现的。我们认为，尽管所有肿瘤样本均为MSI-H，但肿瘤异质性增高导致对ICI治疗的反应较差。可以对同一患者不同病灶间的异质性进行进一步研究，探索哪些患者会显著获益于ICI治疗。除此之外，还应分析免疫相关基因的表达谱，从而明确肿瘤免疫微环境中T细胞的功能障碍和排斥情况。
参考文献：
Kethireddy N, Arvanitis L, LoBello J, Woo Y, Szelinger S, Chao J. A Case Report of Immunotherapy-Resistant MSI-H Gastric Cancer with Significant Intrapatient Tumoral Heterogeneity Characterized by Histologic Dedifferentiation. J Clin Med. 2022 Jun 14;11(12):3413. doi: 10.3390/jcm11123413. PMID: 35743482; PMCID: PMC9224875.