本研究表明变异丰度（VAF）对于符合帕尼单抗联合FOLFOX初始治疗条件的RAS野生型转移性结直肠癌（mCRC）患者是一个预后因素。VAF的鉴别能力高于基线CEA或RECIST，而这样的比较评估对该研究领域来说是有必要的。VAF对肿瘤反应参数没有任何影响，其影响程度在无进展生存期（PFS）方面一般，而在总生存期（OS）方面具有统计学和临床意义。
研究背景
循环肿瘤DNA（ctDNA）除了在早期结直肠癌（CRC）中具有临床应用价值，在转移灶中也具有很好的作用，可用于预后分层、肿瘤反应动态和治疗失败监测、基线和纵向基因组分析。一方面，ctDNA中检测到的肿瘤特异性变异可以根据其与抗EGFR单克隆抗体等特异性靶向药物耐药性或敏感性的相关性来指导治疗选择。另一方面，ctDNA的数量是癌症患者的一个候选预后因素。
在转移性结直肠癌（mCRC）中，癌胚抗原（CEA）被广泛应用于临床实践，以衡量疾病负荷和对现有治疗方案的反应深度。影像学参数如实体肿瘤反应评价标准（RECIST）定义的靶病灶的总数在临床试验中有被记录，肿瘤直径在临床实践中被经验评估，而这些参数有一定的限制，如评估的主观性和观察者之间不一致性。因此，需要在晚期癌症患者的临床管理中应用新的肿瘤扩散替代生物标志物。
初步研究数据显示，与CEA和RECIST相比，ctDNA应答可能具有更强的鉴别能力，但基线ctDNA的预后作用需要在更大的数据集中进行研究，并需要对随机临床试验进行探索性分析。基于这些考虑，在ctDNA中检测到的克隆性基因变异的变异丰度（VAF）是疾病负荷的一个候选生物标志物，可能对mCRC患者有预后价值。
本研究基于Valentino试验，研究基线VAF作为RAS野生型mCRC患者的预后生物标志物，且这些患者接受了抗EGFR的前期治疗策略。此外，本研究将基线VAF与临床常用的其他参数，即CEA和RECIST定义的靶病灶总数进行比较。
研究方法
Valentino的研究（NCT02476045）是一项多中心、随机、非盲法、开放标签Ⅱ期试验，研究了RAS野生型mCRC患者在接受帕尼单抗/FOLFOX-4诱导治疗后，使用帕尼单抗（B组）的维持无进展生存期(PFS)不劣于帕尼单抗联合5-FU/LV（A组）。在签署同意书的患者中，于基线和治疗期间每8周进行一次液体活检（LBs）(独立于治疗周期延迟)，直到疾病进展、撤回同意书或死亡。
在这个预先指定的探索性分析中，研究者纳入了所有具有可评估基线LBs的临床可评估随机患者。采用盲法独立中央回顾评估RECIST 1.1反应、早期肿瘤缩小(ETS)和反应深度(DoR)。由组织下一代测序(NGS)提供可用的肿瘤分析数据。
研究结果
患者特征：
最终的研究队列包括135名病灶可测量和基线LB可获得的患者。总的来说，135名患者中有125名（92.6%）具有可检测的ctDNA（检测panel包括14个基因的热点突变）。中位VAF为12.6%（四分位距范围(IQR)：2.0-45.2%），中位CEA值为29.30ng/ml（IQR：8.51-139.10ng/ml）和中位RECIST定义的靶病灶之和为80.0mm（IQR：50.0–117.5 mm），cfDNA中位浓度为103.0 ng/ul（IQR：68.4–176.5ng/ul）。详情见表1。
表1
值得注意的是，伴有肝转移的患者VAF明显增高。尽管采用了随机分组，但在两个研究组中仍观察到VAF分布的显著不平衡，FU/LV联合帕尼单抗维持组VAF较高。VAF值、CEA值及靶病灶总数呈线性相关(图1)。在大约一半的队列中，TP53是VAF最高的基因（135例患者中73例，54.1%），其次是APC和PIK3CA（分别有31例和6例；图2）。TP53也是中位VAF最高的基因，而RAS突变为亚克隆突变。
图1
图2
VAF对预后的影响：
研究者首先以中位值作为临界值来评估VAF对预后的影响。VAF越高的患者PFS越短（mPFS：9.9 vs 12.7个月；HR：1.27，95%CI：0.89–1.82；p=0.181；Fig. 3a），OS明显较差（mOS：21.8 vs 36.5个月；HR：1.82，95%CI：1.20–2.76；p=0.005；Fig. 3b）。维持期添加5-FU/LV至帕尼单抗的PFS获益独立于VAF(图3c)。与试验结果一致，维持治疗组对两个VAF亚组的OS均无显著影响(图3d)。值得注意的是，在多变量分析中，只有VAF与多变量分析中的OS和PFS相关，而CEA和靶病灶总数则没有（表2）。此外，研究显示VAF、CEA及靶病灶总数与肿瘤反应无显著相关性。
图3
表2
最后，研究者探讨了cfDNA浓度对预后的影响。高cfDNA和低cfDNA患者（以中位数盲切）在OS或PFS方面没有显示出显著不同的结果（分别为p=0.153和p=0.839）。
讨论
本研究表明VAF对于符合帕尼单抗联合FOLFOX初始治疗条件的RAS野生型mCRC患者是一个预后因素。VAF的鉴别能力高于基线CEA或RECIST，而这样的比较评估对该研究领域来说是有必要的。VAF对肿瘤反应参数没有任何影响，其影响程度在PFS方面一般，而在OS方面则具有统计学和临床意义。这些结果可能很容易解释为，前期使用高活性治疗方案引起的疾病控制可能在很大程度上独立于肿瘤负荷，然而肿瘤负荷本身只是预后。
在本研究的患者分子亚组中，TP53、APC、PIK3CA、SMAD4和FBXW7是导致VAF值的关键基因，这些基因在CRC发展早期阶段的高克隆性突变在生物学上支持了VAF值。在该数据集中，BRAF突变的频率非常低。之前的研究表明，基线ctDNA中RAS或PIK3CA突变与Valentino研究中纳入的组织RAS野生型mCRC患者较差的预后相关，表明这些变异可能导致抗EGFR治疗的耐药性。鉴于RAS突变为亚克隆突变，PIK3CA突变通常比其他突变表现出更高程度的空间异质性，研究者认为RAS或PIK3CA突变的亚群与高VAF患者不重叠。事实上，在一小部分患者中（n=12）RAS或PIK3CA检测的VAF最高。因此，研究者推测高VAF的预后影响最有可能与疾病负荷有关，而不是抗EGFR耐药机制的存在。然而，一个值得探讨的假设是，患者具有高疾病负荷可能会增加对EGFR抑制剂产生耐药性的风险，因为该亚组中存在最大的基因组异质性和克隆进化的多样性。
考虑到基线VAF评估简单快速，该生物标志物具有几个潜在的临床应用：首先，它可能被用作未来随机试验的分层因子，或作为一种选择标准来指导患者参加临床试验；其次，基于FOLFOXIRI方案的随机研究的事后分析可能揭示ctDNA负荷的预测作用，并预测强化化疗对高VAF亚组的益处相对较高。本研究未得出任何关于VAF在临床实践中的成本-效益的结论，特别是考虑到CEA的低成本和可重复性。然而，对于基线CEA值在正常范围内的患者，VAF评估可能具有相关性。事实上，无创分子分析ctDNA检测可以同时评估VAF。在本队列中，只有一小部分患者检测不到ctDNA，这不仅可能与特定组织类型和转移部位的非脱落特性或分析前变量有关，还可能与较低的疾病负荷或此类因素的多样性有关。
本研究存在很大的局限性。第一，缺乏对VAF动态的纵向评估。在化疗期间，ctDNA水平下降早于CEA，可作为监测肿瘤反应速度和深度的早期标志物，从而预测影像学再评估。然而，几乎所有的RECIST反应患者4周内检测不到ctDNA。由于VALENTINO试验只在第8周时间点采集了第一个治疗期血浆样本，同时进行了影像学再评估，因此研究者无法评估VAF早期改变的预后影响。其次，LB检测在血液监测和基因分型中的广泛应用可能使医生能够评估疾病进展及其分子驱动因素。此外，根据前瞻性验证，应确定重复LB检测的临床有效性，特别是与标准影像学相比这种监测的额外价值。值得注意的是，ctDNA水平或VAF的上升和下降可能会影响临床试验的设计。第三，该数据不能转化为微卫星不稳定性高或RAS突变mCRC患者的人群，这些患者目前正在接受其他一线标准治疗方案：分别是免疫治疗和化疗+/-贝伐珠单抗。
总之，该研究表明VAF是一种很有前景的预后生物标志物，可能与符合抗EGFR前期治疗方案的RAS野生型mCRC患者的初始疾病负荷相关。
参考文献：
Manca P, Corallo S, Lonardi S, Fucà G, Busico A, Leone AG, Corti F, Antoniotti C, Procaccio L, Smiroldo V, Ratti M, Murialdo R, Racca P, Pagani F, Randon G, Martinetti A, Sottotetti E, Prisciandaro M, Ambrosini M, Raimondi A, Morano F, Pietrantonio F. Variant allele frequency in baseline circulating tumour DNA to measure tumour burden and to stratify outcomes in patients with RAS wild-type metastatic colorectal cancer: a translational objective of the Valentino study. Br J Cancer. 2022 Feb;126(3):449-455. doi: 10.1038/s41416-021-01591-8. Epub 2021 Nov 22. PMID: 34811502; PMCID: PMC8810873.