泛癌种靶向药的获批扩大了晚期实体瘤患者的治疗选择。FDA批准PD-1抑制剂帕博利珠单抗和TRK抑制剂拉罗替尼和恩曲替尼，为所有晚期实体瘤患者进行NGS检测提供了依据，即使是其他方案难治的患者也可能实现临床获益。作为概念验证研究，本病例描述了一例64岁的三阴性乳腺癌女性患者，多线治疗无效，NGS检出罕见突变后接受靶向治疗，获得显著缓解。患者最初进行了局限性乳腺癌治疗，5年后出现转移，经过四线治疗，包括免疫治疗、基于抗体-药物偶联物的治疗和化疗，快速进展。胚系基因检测正常。最终，83基因细胞游离DNA（cfDNA）NGS检出两个NTRK3融合：与罕见分泌性乳腺癌相关的ETV6-NTRK3融合，以及在乳腺癌中尚未描述过的CRTC3-NTRK3融合。对肝活检组织样本进行全外显子组测序和RNA-seq，证实了ETV6-NTRK3和CRTC3-NTRK3融合。开始TRK抑制剂拉罗替尼治疗，仅2个月后就实现临床和影像学显著获益。本病例表明了晚期癌症患者进行NGS检测的潜在巨大益处。
背 景
针对神经营养性酪氨酸激酶（NTRK）1/2/3基因融合的靶向治疗是癌症治疗的重要里程碑。2018年，TRK抑制剂拉罗替尼获批用于NTRK 1/2/3基因变异的实体瘤患者，成为FDA批准的第二款泛癌种靶向药。次年，恩曲替尼同样获批泛癌种NTRK 1/2/3融合适应症。这些批准都是基于篮子试验，入组患者携带NTRK融合，无论组织来源。⩾3级不良事件发生率较低，拉罗替尼常见不良反应包括贫血（11%）、中性粒细胞减少症（7%）、AST/ALT升高（7%）和体重增加（7%）。恩曲替尼常见不良反应包括体重增加（10%）和贫血（12%），神经系统障碍（4%）是最严重的治疗相关不良事件。
总体来看，NTRK融合在乳腺癌中发生率较低，主要见于非常罕见的分泌性乳腺癌，ETV6-NTRK3融合是该亚型特异性变异。分泌性乳腺癌往往呈惰性，很少发生转移。本文描述了一例绝经后女性患者，诊断为具有分泌特征的转移性三阴性乳腺癌（TNBC），经过多线治疗疾病进展。基于血浆的细胞游离DNA（cfDNA）基因检测发现两个NTRK融合：与分泌性乳腺癌相关的ETV6-NTRK3融合，以及未曾在文献中报道过的染色体内CRTC3-NTRK3融合。接受拉罗替尼治疗，2个月后影像学显著缓解，尽管先前多线治疗后疾病进展。
病 例
2014年，一名64岁女性触摸到左乳肿块，检查后诊断为II级、雌激素受体弱阳性（ER+，10%）、孕激素受体阴性（PR-）、人表皮生长因子受体2阴性（HER2-）乳腺癌。肿瘤主要呈微囊状结构，有实质性和乳头状区域，多边形细胞具有嗜酸性空泡状细胞质，囊腔可见密集嗜酸性分泌物。基于这些发现，诊断为具有分泌特征的浸润性导管癌（IDC）（图1）。肿块广泛侵犯胸肌；因此，接受了剂量密集多柔比星和环磷酰胺新辅助治疗，随后每周一次紫杉醇×12（ddACT），接着进行了左乳手术并切除了三个阴性前哨淋巴结。最终病理显示2.6 cm肿块，浸润部位没有明确反应。最终分期为ypT2ypN0M0。接受了辅助放疗，并完成了5年阿那曲唑治疗。
图1. (a) ETV6-NTRK3融合示意图；(b) CRTC3-NTRK3融合示意图；(c) 肿瘤主要呈微囊状结构；(d) 标本由多边形肿瘤细胞组成，具有大的圆形至椭圆形核和嗜酸性空泡状细胞质，囊腔可见密集嗜酸性分泌物。
2020年，术后5年，出现疼痛性颈淋巴结肿大。PET/CT扫描显示胸骨周围复发性侵蚀性胸壁疾病、双肺转移和锁骨上淋巴结转移。后者活检证实为转移性乳腺癌，ER-，因此为TNBC，PD-L1表达1%（肿瘤细胞），Ki-67 20%。胚系基因检测显示ATM、BRCA1、BRCA2、CDH1、CHEK2、NBN、NF1、PALB2、PTEN、STK11和TP53突变阴性。
随后，接受了多线治疗，每线治疗早期重新分期均评估为疾病进展。治疗包括阿替利珠单抗/nab-紫杉醇（5个月后进展）、吉西他滨/卡铂（3个月后进展）、基于戈沙妥珠单抗的治疗（2个月后进展）和艾立布林（2个月后进展）。对胸壁肿块进行了两次活检，结果显示IDC，可见胞浆内粘蛋白。
在开始基于戈沙妥珠单抗治疗之前，使用Guardant360进行了外周血cfDNA NGS检测，覆盖83个基因。检出ETV6-NTRK3融合，变异丰度（MAF）为3.8%。3个月后，在戈沙妥珠单抗治疗失败后，对新的血液样本进行重复Guardant检测，发现ETV6-NTRK3融合MAF从3.8%增加到10.9%，并且还发现了新的CRTC3-NTRK3融合，MAF为3.2%。进行了肝活检，进行BostonGene检测（基于组织的全外显子组测序和RNA-seq平台），证实了ETV6-NTRK3和CRTC3-NTRK3融合（图1）。
随后，开始拉罗替尼治疗。2个月后的复查扫描显示，肺、胸膜、淋巴结和胸壁转移病灶显著改善，首次实现客观缓解。CA 15-3，之前持续上升，也从最高时206 IU/mL降到了48 IU/mL。随后血液样本重复Guardant检测显示，ETV6-NTRK3融合MAF从10.90%降至0.40%，CRTC3-NTRK3融合MAF从3.20%降至0.07%（图2）。拉罗替尼耐受情况较好，未进行剂量减少或调整。主要副作用有贫血和水肿。继续使用拉罗替尼7个月，疾病控制情况良好。不幸的是，与治疗无关，由于已有骨转移，发生多次骨折，导致疾病负荷重。最终，患者和家人选择了转为安慰措施，之后患者去世。
图2. (a) 患者的临床时间线；(b) 左侧图像：胸部CT显示多个肺和胸膜转移病灶，右侧图像：拉罗替尼治疗2个月后这些病灶显著改善。两个NTRK3融合MAF降低。
讨 论
本文描述了一例TNBC患者，多线治疗后疾病进展，直到基因检测发现两个NTRK融合，开始TRK抑制剂治疗，2个月后临床获益显著。通过血浆基因检测发现NTRK融合，从而能够进行匹配的靶向治疗，这对转移性乳腺癌患者，特别是分泌性组织学亚型的患者来说，是值得考虑的。
NTRK融合较为罕见，现在已引起极大关注，因为携带NTRK融合的患者可以接受相应靶向治疗，不论癌症组织起源。然而，NTRK融合在成人实体瘤中的检出率仅约0.3%。NTRK 1/2/3编码TrkA/B/C，这些蛋白的融合导致配体非依赖性二聚化和随后下游MAPK和PI3K-AKT通路激活。对FoundationCORE数据库295000多例癌症患者进行的一项大型研究也发现，约0.30%的实体瘤存在NTRK融合，覆盖45种不同癌症889例患者，包括88个不同的融合伴侣。在295例融合伴侣已知的成人中，ETV6最常见（n = 78, 26.4%）。在乳腺癌中，14例患者伴侣为ETV6（14.7%）。有趣的是，本文患者CRTC3-NTRK3融合涉及的融合伴侣在这些大型数据集中似乎没有描述过。ETV6-NTRK3是染色体间融合t（12；15）（p13；q25），而CRTC3-NTRK3是染色体内融合。不幸的是，我们没有患者最初标本的NGS数据，尽管考虑到分泌性病理，ETV6-NTRK3融合很可能已经存在。后来，cfDNA检测在ETV6基因另一个融合位点发现低MAF ETV6-NTRK3融合，对cfDNA NGS的更深入研究提示，这些基因变异实际上可能是交叉的，一个基因的外显子可能与另一个基因的内含子融合，多个融合reads可能反映了更复杂的事件（图3）。
图3. (a) NTRK3、EVT6和CRTC3基因示意图；(b) cfDNA检出的最初ETV6-NTRK3融合示意图；(c) cfDNA检出的第二种ETV6-NTRK3融合示意图；(d) cfDNA检出的CRTC3-NTRK3融合示意图；(e) cfDNA检出的NTRK3-NTRK3内部融合。
拉罗替尼和恩曲替尼的出现开启了新的肿瘤治疗格局。拉罗替尼的组织不确定批准依据的是三项单臂篮子试验：LOXO-TRK-14001（NCT02122913）、SCOUT（NCT02637687）和NAVIGATE（NCT02576431）。对这三项研究的综合分析显示，55例被评估为不可切除或转移性实体瘤患者的总体缓解率（ORR）为75%（95% CI: 61-85%），随后对153例患者的分析发现ORR为79%（95% CI: 72-85%），其中24例患者（16%）达到完全缓解。恩曲替尼的批准同样基于对三项单臂临床试验的综合分析：ALKA-72-001（GO40783）、STARTRK1（NCT02097810）和STARTRK2（NCT02568267）。在这项分析中，54例成人患者的ORR为57%（95% CI: 43–71%），63%的患者缓解持续时间⩾6个月 。有趣的是，批准并不取决于融合伴侣。这些新的组织不确定适应症开启了精准医疗新领域。
可以从这个独特的病例学到几点。首先，基于患者切除样本显微特征，诊断为具有分泌特征的IDC，这应该是进一步进行基因检测的第一条线索。与典型IDC相比，分泌性乳腺癌在组织学和基因组学上与唾液腺癌更相似，均存在ETV6-NTRK3基因融合。此外，虽然实体瘤中NTRK融合总体上很少见，但在分泌性乳腺癌中，NTRK-ETV6融合是诊断的关键。病理学特征结合ETV6-NTRK3融合，促进罕见分泌性乳腺癌的诊断。目前，尚无NTRK融合转移性乳腺癌基于生物标记物使用TRK抑制剂的已发表研究。
分泌性乳腺癌在乳腺癌中占比不到1%。这种亚型最初在儿童和青少年中被描述为“青少年癌”。然而，后来发现，9岁至69岁（中位年龄25岁）的患者也报告了具有相同分泌特征的类似癌症；使其被重新归类为“分泌性乳腺癌”。有趣的是，乳腺癌初始驱动突变一直很难明确，而ETV6-NTRK3融合是一个已知例外，解开了乳腺癌基因组进化谜团的一部分。分泌性乳腺癌是儿童和青少年中描述过的少数几种乳腺癌之一。
分泌性乳腺癌通常为三阴性，与非分泌性乳腺癌相比，通常表现为侵袭性较低，转移风险较低，且伴随基底样免疫表型的三阴性特征。这种惰性生长模式与唾液腺癌相同。本文患者肿瘤的自然病程更具侵袭性，术后5年发生远处转移，并对多线系统治疗耐药。本病例突出了关于罕见疾病的一个有趣观点。由于缺乏来自大型人群研究的数据，通常很难全面分析罕见疾病的自然史范围。那么就有一个问题，该患者疾病是否真的非典型，还是相关文献较少的不同表型。此外，尽管病程具有侵袭性，靶向NTRK融合治疗是控制该患者其他方案难治疾病的关键。
本文患者在免疫治疗后疾病快速进展也可能是NTRK融合实体瘤的特征性行为。一项前瞻性筛查26000例患者的大规模单中心研究发现了76例NTRK融合，与成人人群中0.28%的发生率一致。这似乎是有临床数据的NTRK融合相关最大研究。分泌性乳腺癌占NTRK阳性病例的大多数，非分泌性乳腺癌仅占0.08%（3/3775）。在所有肿瘤类型中，NTRK融合患者的肿瘤突变负荷往往较低，免疫治疗总体疗效往往较差，除了在结直肠癌中，微卫星不稳定与NTRK融合似乎同时发生。通过BostonGene平台进行的全转录组测序发现了成纤维细胞活化的肿瘤微环境，这与免疫治疗疗效较差相关。
多项NTRK融合相关研究表明，NTRK融合是致癌驱动变异，往往与其他驱动变异相互排斥。NTRK融合也常为克隆事件;上述前瞻性筛查队列包括17例接受连续活检的患者，其中14例患者连续活检发现新获得的融合。亚克隆NTRK融合也被报告为假定的获得性脱靶耐药机制，例如，在非小细胞肺癌中，酪氨酸激酶抑制剂治疗后，与EGFR驱动突变同时存在。
鉴于分子靶向治疗的重要性，人们越来越认识到需要灵敏度高的方法，来检测可能会影响生物学和疗效的新获得的分子事件。有几种检测NTRK融合的方法，包括基于DNA的NGS、基于RNA的NGS，免疫组化（IHC）和荧光原位杂交（FISH）。在这些技术中，RNA测序似乎灵敏度最高。在上述MSK-IMPACT检测中，26%（12/46）的患者RNA检出的融合DNA没有检出。所有这12例患者都是由于NTRK2/3内含子内断点，这些内含子区域太大，基于DNA的MSK-IMPACT检测没有完全覆盖。这种差异突出了基于DNA的NTRK检测的局限性。尽管如此，基于DNA的测序的灵敏度为81.1%，特异性为99.9%。IHC的特异性为81.1%，但检测NTRK3融合的灵敏度仅为79%。此外，在融合频率高的情况下，IHC的特异性较低，如分泌性乳腺癌和唾液腺癌（82%和52%）。因此，IHC与更多假阴性和假阳性相关。一项研究纳入了305例TNBC患者，IHC检测发现32例（11.1%）阳性病例。进行FISH检测来验证，发现13例患者携带NTRK融合。然而，随后的NGS和RT-PCR检测显示，除一例患者外，其余患者均为NTRK融合阴性。ESMO指南推荐NGS作为标准方法，如果IHC是初始检测方法，随后应进行NGS检测。类似地，基于组织样本的NGS平台，通过FoundationOne检测NTRK融合，FDA批准了拉罗替尼的伴随诊断。
由于这些罕见基因变异可治疗，检出这些变异对于患者很重要，尤其是对于TNBC等异质性疾病患者。尽管先前认为TNBC是一种无可靶向治疗变异（如ER、HER2）的疾病，但本病例表明，事实上，TNBC人群中有患者获益于靶向治疗，特别是分泌性组织学亚型患者，由于固有的NTRK3融合，可能临床获益显著。因此，最近美国临床肿瘤学会（ASCO）发布了关于乳腺癌生物标记物检测的最新指南，以及一项暂行推荐：如果晚期实体瘤患者可能存在不止一种生物标志物可导致靶向治疗，应接受体细胞检测。鉴于帕博利珠单抗获批用于微卫星不稳定和/或高肿瘤突变负荷组织不确定癌症患者，以及类似地，拉罗替尼和恩曲替尼获批用于NTRK融合患者，推荐所有晚期实体瘤患者进行体细胞检测，这也反映在当前NCCN指南3.2022版中，其中推荐IV期（M1）或复发性乳腺癌进行全面胚系和体细胞检测，看是否可能获益于额外靶向治疗。随着对乳腺癌患者基因图谱和可治疗变异的了解不断深入，我们认为患者的基因检测结果可以指导治疗，可能实现临床获益，正如本病例患者。
参考文献：
Medford AJ, Oshry L, Boyraz B, et al. TRK inhibitor in a patient with metastatic triple-negative breast cancer and NTRK fusions identified via cell-free DNA analysis. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 2023;15. doi:10.1177/17588359231152844