食管鳞状细胞癌（ESCC）在新辅助治疗期间需要准确的肿瘤负荷监测方法来指导治疗。日本庆应大学医学院开展了一项研究，探索了在接受新辅助化疗（NAC）+食管切除术的患者中，血浆循环肿瘤DNA（ctDNA）的临床效用。从接受NAC+食管次全切除术的组织学诊断为ESCC的患者中，纵向收集了血浆样本用于ctDNA检测，此外，还收集了原发性肿瘤样本。对血浆和原发性肿瘤样本进行了NGS检测。评估了局部晚期ESCC患者ctDNA变化与病理缓解和复发的相关性。在13例患者的治疗前样本中，11例患者（85%）ctDNA和原发性肿瘤检出多个一致突变，这些患者被归类为治疗前ctDNA阳性。NAC后ctDNA阳性率与病理缓解相关（缓解者，25%; 未缓解者，100%; p = 0.007）。对16例患者进行的分析显示，术后ctDNA阳性患者复发风险显著增加，ctDNA阴性组和ctDNA阳性组的1年无复发生存率分别为90%和0%（p = 0.0008）。在2例术后复发患者中，ctDNA检出时间比影像学诊断时间早约5.5个月。本研究表明，ctDNA可作为预测ESCC病理缓解和术后复发的潜在标志物。为了验证本研究结果，我们正在准备一项多中心前瞻性研究。
研究背景
食管癌是全球癌症相关死亡的第六大原因，5年生存率低于25%。为了改善生存结果，已开发了多学科治疗，包括手术、化疗和放疗。对于可手术切除的食管癌，术前治疗+手术是标准治疗方案。CROSS试验显示，与单独手术相比，新辅助放化疗（NACRT）+食管切除术带来生存优势，基于此，西方国家已采用NACRT术前治疗。然而，日本推荐进行不含放疗的新辅助化疗（NAC）。基于JCOG9907研究，顺铂+5-氟尿嘧啶（CF）新辅助治疗是标准方案。最近，三臂III期JCOG 1109试验显示，CF+多西他赛（DCF）新辅助治疗优于CF新辅助治疗。该试验表明，比CF新辅助治疗相比，DCF（但非NACRT）新辅助治疗延长了局部晚期食管鳞状细胞癌（ESCC）的总生存期，毒性可控。最近，来自85所日本癌症中心的食管癌真实世界数据证明了DCF新辅助治疗带来的生存优势。三药化疗除了改善术后生存率外，还提高了缓解率，病理完全反应（pCR）率更高。DCF治疗患者的pCR率约为20%。此外，免疫检查点抑制剂新辅助治疗有望进一步提高pCR率。
食管癌治愈方法以手术切除为主，但食管切除术具有高度侵入性，并且有术后并发症风险。器官保留方案包括无手术的积极监测，在NACRT为标准方案的西方国家用于临床完全缓解的患者。SANO试验评估了器官保留方案的安全性和有效性。为了选择哪些患者可以保留器官，应准确评估肿瘤负荷。然而，目前计算机断层扫描 （CT）、食管胃十二指肠镜检查 （EGD） 和正电子发射断层扫描 （PET） 联合检查的准确性并不令人满意。在接受NAC治疗的患者中，38%的缓解者NAC后没有显示粘膜残留病灶，提示常规活检无法发现NAC后的残留病变。因此，需要可以精确反映肿瘤负荷的监测方法。
术前发现pCR具有临床价值，识别病理缓解者也具有临床价值。我们之前报道过病理缓解是ESCC的重要预后因素。此外，术后复发的病理缓解者出现局部复发，没有出现远处转移，可以指导NAC治疗缓解者保留器官，进行后续CRT。一项多中心II期试验（CROC试验）评估了选择合适的患者在DCF后接受CRT、省略手术的有效性。显著缓解者后续进行了CRT，90%达到完全缓解，3年时的总体器官保留生存率为 45%。然而，仍然缺乏可靠的检测方法来评估术前病理缓解者。
在几种类型癌症中，循环肿瘤DNA（ctDNA）检测是监测肿瘤负荷的有前途的方法。ctDNA检测的优点包括易于重复采样，降低侵入性，能够灵敏反映癌症动力学。Azad等人的研究显示，在食管癌中，放化疗后ctDNA监测有助于发现早期肿瘤复发。
因此，基于ctDNA的精准肿瘤监测对术后DCF新辅助治疗策略主要有两大临床意义。首先，能够定量和高度准确了解DCF新辅助治疗后的缓解情况，预测预后。此外，根据CROC试验结果，当患者强烈倾向于器官保留时，或许能够建议随后根治性CRT作为一种选择。其次，可以通过术后ctDNA预测复发。术后不进行辅助治疗是标准方案，但术后纳武利尤单抗或TS-1也可作为一种选择。然而，其有效性尚不明确，如果ctDNA能够准确识别复发风险低的人群，则可以确定哪些人群不需要辅助化疗。
据我们所知，目前尚无关于ctDNA评估ESCC患者NAC治疗疗效的研究。本研究探索了血浆ctDNA在ESCC新辅助治疗中的临床效用，评估了纵向血液样本ctDNA存在与否与病理缓解情况的一致性。此外，分析了ESCC患者术后ctDNA预测术后复发的作用。
研究结果
ESCC患者治疗前特征和ctDNA检测结果
队列 A 包括18 例诊断为晚期食管癌的患者，2019年10月至2021年3月期间，这些患者接受了NAC+食管次全切除术。排除了血液样本或原发灶活检样本不可及的患者。最终，队列A分析了13例患者。队列 B包括22例诊断为局部晚期食管癌的患者，2020年1月至2022年5月期间，这些患者接受了NAC+食管次全切除术。根据条件排除后，最终，队列B分析了16例患者。表1总结了队列A患者的基线临床病理特征。大多数患者为男性（77%），分别有3例（25%）、3例（25%）、2例（15%）和5例（39%）患者临床分期为I期、II期、III期和IV期。9例患者可手术切除，包括1例锁骨上LN转移的IV期患者。其余4例患者患有临床T4b疾病或发生远处转移。如表2所示，手术结果，包括术后并发症，与先前报告的一致。
表1. 队列A患者临床病理特征
表2. 手术结果
NAC前的ctDNA突变谱如图1所示。在NAC前，4/6例（67%）临床分期为I/II期的患者ctDNA呈阳性，所有III/IV期患者ctDNA均呈阳性。11例患者ctDNA突变阳性，包括11例（85%）患者检出TP53突变，1例患者同时还检出CDKN2A和NFE2L2突变。
图1. 13例患者新辅助化疗前的ctDNA突变谱和TP53变异丰度
NAC前后ctDNA状态变化和治疗疗效
13例患者纵向ctDNA监测如图2a所示。11/13例患者基线ctDNA阳性。4例患者被归为缓解者：P01、P02和P03被归为pGrade2（超过三分之二的肿瘤坏死或纤维化改变），P04被归为pGrade1b（三分之一到三分之二的肿瘤坏死或纤维化改变）。3/4例病理缓解者（P01，P02和P04）NAC后ctDNA转为阴性。如图2b所示，NAC后的ctDNA阳性率与病理缓解显著相关（缓解者，25%; 未缓解者，100%; p=0.007）。ctDNA阳性或阴性预测缓解情况的灵敏度为1.00，特异性为0.75，假阳性率为0.25，假阴性率为0，准确性为0.91。影像学疗效评估显示，在NAC前有可测量病灶的5例患者中，NAC后，2例达到PR，3例SD。其余8例患者没有可测量病灶。此外，2/4例缓解者在NAC前有可测量病灶，NAC后，1例达到PR，另1例SD。4例ctDNA阳性患者术后血清SCC水平持续1个月在正常范围内。
图2. a 13例患者临床时间线和纵向ctDNA监测；b 缓解者（pGrade 1b–3）和未缓解者（pGrade 0和pGrade 1a）ctDNA阳性率比较
可手术切除患者术后ctDNA状态和复发
分析了队列B的16例可切除患者术后1或3个月时的血液样本。人口统计学特征见表3。术后，6例患者ctDNA阳性，2例患者ctDNA阴性。在ctDNA阳性患者中，1例术后3个月死于肺炎，其余患者术后1年内出现复发。如图3所示，ctDNA阴性患者的1年RFS为90%，而ctDNA阳性患者为0%（p = 0.0008）。使用Cox比例风险模型，ctDNA阳性患者与阴性患者的风险比为16.9（95% CI：1.92–149.4）。基于观测数据，风险比为16.9，事件总数为6，分布比为1：2，双侧显著性水平为5%，logrank检验的统计功效为0.904，有一定的功效水平。
表3. MRD分析患者特征
图3. 术后ctDNA阳性和ctDNA阴性患者RFS Kaplan–Meier分析
术后ctDNA纵向评估及复发
2例术后1年内复发的患者进行了连续ctDNA评估。NAC前后内镜图像，复发时PET以及血清SCC水平连续趋势如图4所示。病例1（图4a）：术后3个月，ctDNA呈阳性，血清SCC水平正常；术后8个月，PET显示多处远处转移，血清SCC水平升高。病例2（图4b）：术后1个月，ctDNA呈阳性，术后血清SCC水平保持正常；术后7个月，PET显示复发。在这2例病例中，ctDNA阳性都先于PET-CT复发，平均早5.5个月。
图4. 术后复发患者新辅助化疗前后内镜图像、复发时PET图像、手术前后ctDNA丰度动态、血清鳞状细胞癌抗原水平
讨 论
本研究表明，局部晚期ESCC患者临床病程中ctDNA纵向监测能够反映肿瘤负荷变化。基于这些结果，ctDNA是潜在的术前NAC疗效预测标志物。此外，术后ctDNA与术后复发密切相关，提示根治性手术后ctDNA反映MRD。据我们所知，本研究首次表明了在接受NAC+手术的可切除ESCC患者病程中，ctDNA监测肿瘤负荷的临床价值。这对于辅助治疗和器官保留方案的选择具有重要意义，这类患者无需手术切除即可治愈。
当ctDNA监测应用于肿瘤负荷低于转移性疾病的可切除疾病时，血浆ctDNA检出率受到关注。在本研究中，11/13例（85%）患者治疗前ctDNA阳性，67%的I或II期患者呈阳性，尽管肿瘤为局限性。这些结果表明，本研究使用的panel能够在较早期发现肿瘤信号。先前一项研究探索了食管腺癌的ctDNA水平，只有33%的I期或II期患者ctDNA呈阳性。本研究中ESCC患者的检出率优于该研究中的腺癌患者，因此，即使是早期ESCC也可能适合ctDNA监测。此外，85%的患者中ctDNA检出TP53基因突变。大约58-93%的ESCC患者cfDNA检出TP53基因突变，与本研究结果一致。此外，基于可手术切除患者ctDNA检出率相对较高，ctDNA监测适用于ESCC。先前的食管腺癌研究显示，丰度（VAF）约为0.05-5.30%，本研究数据与其一致。此外，只有与原发灶突变相同的突变被定义为ctDNA，不包括意义未明的克隆性造血（CHIP）相关突变。
对于可手术切除的晚期ESCC，NAC后的ctDNA状态反映了治疗疗效。换句话说，NAC后ctDNA阴性是NAC病理缓解的可靠指标。既往研究没有分析ctDNA状态与NAC病理缓解的一致性。本研究结果支持ctDNA检测用于筛选术前病理缓解者。目前SANO试验正在研究器官保留方案的安全性和有效性，在该试验中，NACRT后临床完全缓解的患者不进行手术，采用积极监测。然而，由于缺乏可靠的检测方式，缓解者的诊断标准尚未标准化。虽然内镜检查可捕获原发性肿瘤，但很难发现MRD。NAC后几乎一半的残留病灶位于粘膜下层或更深。因此，即使是活检也无法准确检测残留疾病。鉴于ctDNA可以反映全身残留疾病，而内镜检查可以检测局部疾病，因此ESCC多学科治疗联合使用这些方法或能准确监测肿瘤负荷。
尽管既往也有研究纳入了较多原发性肿瘤患者评估了ctDNA的效用，但临床终点是肿瘤负荷降低程度，这可能不如病理缓解标准客观。本研究发现，NAC后ctDNA与病理缓解存在显著相关性，灵敏度和特异性高。本研究采用的是NGS而不是数字PCR，这种全面的方法有助于提高ctDNA评估准确性。关于预后，先前有研究在NAC期间监测ctDNA变化。然而，术后MRD评估更有效。术后ctDNA检测结果明显分层了术后复发风险。总体而言，ctDNA监测对于准确识别术前病理缓解者和预测术后预后很有价值。
关于RECIST标准与缓解者的相关性，RECIST不太通用，因为食管癌没有可测量病灶。RECIST标准和缓解者并不总是匹配的，＜50%的患者有可测量病灶。此外，既往关于黑色素瘤的研究报告，使用ctDNA可以准确判断PD和假PD，而影像学很难判断，提示ctDNA在准确识别化疗疗效方面比影像学更有用。
在2例术后复发的患者中，血液ctDNA阳性比影像学发现肿瘤复发早约5.5个月出现。这与之前的一项研究相似，在该研究中，ESCC患者ctDNA水平升高比影像学提示复发提前约6个月。因此，ctDNA对于预测根治性食管切除术后的复发很有价值。最近，CheckMate 577试验显示，在接受NACRT+食管切除术的局部晚期食管癌患者中，免疫检查点抑制剂纳武利尤单抗辅助治疗可以延长无病生存期。然而，由于免疫相关不良反应，可能会出现一些不可逆的毒性，术后纳武利尤单抗辅助治疗会造成经济负担。ctDNA监测可以准确评估术后复发风险，指导辅助治疗的应用。
本研究有几个局限。首先，样本量相对较小。尽管需要开展更多更大型研究，但ctDNA和NAC疗效的显著相关性以及明显的风险分层表明ctDNA是监测肿瘤负荷的有用标志物，无论是NAC还是术后阶段。作为补充，为了证明因果推理的稳健性，我们使用Schoenfeld方法，基于log-rank检验回顾性计算了统计功效。根据观测数据，功效为0.904，有一定的功效水平。尽管由于患者数量少，HR置信区间范围较大，但我们认为，本研究的功效是足够的。其次，本研究采用了肿瘤知情方法来消除CHIP的影响。尽管DNA是从原发灶的几个部位提取的，但由于肿瘤的异质性，几个突变被忽略了。另一方面，在本研究中，需要连续血液样本和原发灶活检样本，因此，如果有样本无法获取，很难进行分析。然而，如果能够成功获取样本，分析成功率为100%。
总之，在接受NAC+手术治疗的ESCC中，ctDNA可作为监测肿瘤负荷的潜在标志物。开展更大队列研究验证这一结果，有助于ESCC基于ctDNA的个体化多学科治疗。目前，我们正在准备一项多中心前瞻性研究，进一步验证本研究结果。
参考文献：
Morimoto Y, Matsuda S, Kawakubo H, Nakamura K, Kobayashi R, Hisaoka K, Okui J, Takeuchi M, Aimono E, Fukuda K, Nakamura R, Saya H, Nishihara H, Kitagawa Y. ASO Visual Abstract: Tumor Burden Monitoring with Circulating Tumor DNA During Treatment in Patients with Esophageal Squamous Cell Carcinoma. Ann Surg Oncol. 2023 Apr 5. doi: 10.1245/s10434-023-13391-w. Epub ahead of print. PMID: 37016011.