BRAF D594G突变晚期肺鳞癌获益达拉非尼+曲美替尼？或与NF1共突变有关

一名75岁吸烟男性患者，被诊断为同时罹患右肺尖和右肾肿瘤，并转移至纵隔和肺门淋巴结以及骨骼（图1a，b）。肾活检标本显示低分化鳞状细胞癌。随后的开胸活检结果也显示为鳞状细胞癌（p40[+]、CK7[+]、TTF1[−]、CK20[−]、CD10[−]、Vimentin[−]、Napisn A[−]、PAX8[−]）。在2%的肿瘤细胞中发现PD-L1的表达。患者的共病史包括心肌梗死后遗症、2型糖尿病、骨髓增生异常综合征（MDS）和痛风。

图1. CT显示右肺尖部肿瘤转移至纵隔和肺门淋巴结(a)以及右肾转移病灶(b)。

在肿瘤科会诊后，患者接受卡铂、紫杉醇和帕博利珠单抗进行化疗联合免疫治疗。晚期肺鳞癌患者如果仍能保持良好的体力状态（PS），应在一线治疗选择化疗联合免疫治疗或免疫治疗。化疗联合免疫治疗方案包括帕博利珠单抗（pembrolizumab）联合卡铂和紫杉醇/nab-紫杉醇，以及纳武利尤单抗和伊匹木单抗联合两个周期的含铂化疗。帕博利珠单抗或西米普利单抗（cemiplimab）可用于PD-L1表达≥50%的癌细胞的SqCC患者，阿替利珠单抗（atezolizumab）可用于PD-L1表达≥50%的癌细胞或免疫细胞≥10%的患者。仅在出现免疫治疗禁忌症的情况下，才能单独使用含铂一线化疗。EGFR、ALK和ROS1基因以及其他遗传预测因子的检测在非吸烟SqCC患者中有意义。当检测到这些基因异常时，应在一线治疗中使用分子靶向治疗。二线含铂化疗用于一线单药治疗中接受免疫治疗的患者。多西他赛单药或联合雷莫芦单抗（ramucirumab，抗EGFR抗体）是一线接受化疗联合免疫治疗患者的二线治疗，也是免疫治疗后接受含铂化疗患者的三线治疗。如果免疫治疗未用于一线治疗（通常是出于非医疗原因），阿替利珠单抗、纳武利尤单抗或帕博利珠单抗可用于二线治疗。

由于MDS和中性粒细胞减少症并存，引入化疗联合免疫治疗的决定被推迟，并给予粒细胞生长因子治疗。患者接受了两个周期的帕博利珠单抗减剂量化疗。化疗联合免疫治疗期间出现难以忍受的并发症，包括血小板减少。由于骨髓增生异常综合征和骨髓功能障碍，放弃进一步化疗。患者继续接受帕博利珠单抗治疗7个周期，之后观察到胸部（原发肿瘤大小增加，双肺出现大量转移性结节）、腹部（肾肿瘤增大）和骨骼的疾病进展（图2a）。患者还接受了骨转移的放射治疗和双膦酸盐治疗。

图2. 在帕博利珠单抗维持治疗期间CT扫描结果(a)；

后续使用达拉非尼和曲美替尼治疗后，CT扫描显示有效(b)

因此，对采集的肺部肿瘤标本进行了NGS检测，测序结果显示了已知和未知的致病突变。首先，在来自肺的FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）样本中鉴定出BRAF （B-Raf原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶）基因（NM_004333）突变。该基因15号外显子发生c.1781A>G（p.Asp594Gly, p.D594G）的取代。第二个有临床意义的突变是NF1（神经纤维蛋白1）基因（NM_001042492）中的c.1381C>T （p.Arg461Ter, p.R461*）。第三个有临床意义的基因变异是FANCC（范可尼贫血互补群C型）基因（p.Gln13Ter）中的C.37c>T突变。给予患者达拉非尼和曲美替尼治疗，结果证实有效——肺肿瘤减小，骨转移和肾转移稳定（图2b）。该治疗方案持续了5个月。与之前帕博利珠单抗维持治疗进展时的CT结果（图2a）相比，右肺门的肿瘤肿块（63×45 m㎡）情况稳定（图2b）。与之前的检查相比，转移病灶减少：右肺第6段病灶从24mm减少到21mm，左肺第1/2段结节从11mm减少到9mm，右肺第2段结节从12mm减少到7mm。右肺主支气管下方的淋巴结尺寸也从26mm缩小到20mm。根据RECIST v1.1标准，患者实现疾病稳定（SD）。病情稳定持续了5个月。在此之后，由于MDS进展导致红细胞和血小板数量减少，患者的表现状态恶化。治疗停止。之后，患者疾病进展迅速，在开始使用BRAF和MEK抑制剂治疗6.5个月后死亡。

在征得卢布林医学院生物伦理委员会同意的基础上，患者书面同意参加这项研究。

讨论

本文中患者的靶向治疗涉及BRAF和MEK抑制剂。在一项2期研究的BRAF基因p.V600E突变的预治疗（队列B）和未治疗（队列C）患者中，达拉非尼联合曲美替尼的疗效已得到证实。B组和C组患者的客观缓解率（ORR）分别为68.4%和63.9%，中位无进展生存期分别为10.2和10.8个月，中位总生存期分别为18.2和17.3个月。研究表明，使用单一BRAF抑制剂（维莫非尼，vemurafenib）治疗非v600e突变的肺癌患者是无效的，因为药物对非v600e的BRAF突变的亲和力低或无亲和力。然而，有报道称，接受维莫非尼治疗的BRAF p.L597R突变的黑色素瘤患者有部分缓解。使用达拉非尼联合曲美替尼（阻断BRAF和MEK），可能在BRAF非v600突变的患者中也有效，因为曲美替尼有效地阻断了MAPK （MEK）通路（图3）。有研究人员使用NGS技术发现了独特的BRAF变异，包括非小细胞肺癌患者的扩增和错义突变。3例非v600突变患者接受BRAF和MEK抑制剂治疗。p.G469V和p.D594G突变的患者疾病进展迅速，而p.L597R突变的患者有持续的部分反应。一项研究显示，一名T599dup突变的NSCLC患者在铂类和培美曲塞化疗失败后，用达拉非尼联合曲美替尼治疗，实现了疾病稳定（SD），而一名K601E变异的患者出现了疾病进展（PD）。在BRAF基因15号外显子发生的D594G突变（就像我们的病人）很可能降低了BRAF激酶的活性，但没有使其失活（图4）。该蛋白仍能传递信号，很可能是由于NF1失活导致的RAS过度激活而增强了BRAF激酶，因为NF1的失活可以在野生型患者中阻断该蛋白。因此，达拉非尼（对非BRAF v600突变的癌细胞疗效较差）和曲美替尼（阻断MEK激酶）的协同作用似乎可以抑制增殖信号并导致肿瘤缩小。

图3 BRAF和NF1信号转导通路方案

图4 达拉非尼与人BRAF激酶V600E或D594G突变的分子对接模型。

(A) BRAF激酶V600E突变体中的达拉非尼结合位点（紫色）呈现能量最低取向。此外，在BRAF激酶D594G突变体模型的复合物中显示了能量最低的两个取向（橙色和浅蓝色）。右图为达拉非尼与参与结合的残基相互作用的3D图。氢键用黑色箭头标记，残基用下划线标注。配体取向呈现为球状模式（左侧）和棒状模式（右侧），而参与配体结合的残基（右侧）呈现为棒状模式（氮为蓝色，氧为红色，氢为白色）。

(B) BRAF激酶V600E突变体中达拉非尼与结合位点相互作用的2D图;

(C,D) BRAF激酶D594G突变体中达拉非尼以两种（高亲和力和低亲和力）方向结合的2D视图。

涉及达拉非尼结合的残基显示在图中(B-D)。氢键用粉色箭头标记，是疏水相互作用中的残基。

达拉非尼在人BRAFp.V600E或p.D594G突变激酶模型中的分子对接

研究人员使用人BRAF激酶和达拉非尼复合物（2.66Å[埃]原子分辨率，[PDB ID: 5CSW]）构建p.D594G突变体模型。此外，也使用BRAF激酶p.V600E突变体的晶体结构（2.65 Å原子分辨率，[PDB ID: 4FK3]）用于分子建模研究。如前所述，达拉非尼的分子结构取自BRAF激酶与达拉非尼配合物的晶体结构。然后，使用半经验AM1方法对该分子进行几何优化。随后将柔性达拉非尼分子与携带p.D594G或p.V600E突变的BRAF激酶模型进行分子对接。所选grid-box尺寸为34Å×30Å×30Å，grid-point间距为1Å，以确保覆盖实验所确定的人BRAF激酶中的达拉非尼结合位点。其中能量较低的结合方式被选中，如图4所示。

分子对接结果表明，在携带p.D594G或p.V600E突变的BRAF激酶模型中，可能存在能与达拉非尼结合的位点和结构成分（图4A）。在BRAF激酶p.V600E突变模型中，达拉非尼与疏水残基（Phe468、Ile463、Val471、Ala481、Leu505、Leu514、Ile527、Trp531、Cys532、Ile582、Phe583和Phe595）和极性残基（Ser465、Thr529、Gln530、Asn581和Asn580）相互作用。特别的是，Lys483与氟苯基和1，3-噻唑基之间存在阳离子-π相互作用。配体与Asp594和Asn580之间存在两个氢键（图4B）。

在BRAF激酶p.D594G突变体模型中，对接结果表明达拉非尼与V600E突变体的结合位点相同，但提出了几种不同的取向，如图4A所示。更具体地说，在每个呈现的方向上，分子与疏水残基（Phe468, Ile463, Val471, Ala481, Leu505, Ile513, Leu514, Phe516, Ile527, Trp531, Cys532, Ile582, Phe583和Phe595）和极性（Ser465, Thr508, Thr529和Gln530）残基相互作用。在每个取向上，达拉非尼与Lys483和Phe595之间至少存在两个氢键（图4C，图4D）。在BRAF激酶p.D594G突变体模型中，阳离子-π与Lys483残基和氟苯基或2-氨基-4-嘧啶基部分在每个方向上都存在相互作用。

综上所述，分子对接结果与临床数据基本一致。特别是，在BRAF激酶p.V600E和p.D594G突变模型中发现了相同的达拉非尼结合位点。

BRAF突变患者的分子背景

在患者的肿瘤FFPE样本中发现了神经纤维蛋白1基因（NF1，NM_001042492）12号外显子的突变c.1381C>T（p.Arg461Ter, pR461*）。该突变具有致病性，与1型神经纤维瘤病和遗传性家族性癌症综合征有关。C>T的核苷酸替换导致氨基酸编码从精氨酸变为终止密码子。NF1基因是RasGAP家族的典型成员。NF1突变导致的功能丧失也在肺癌和许多其他癌症中有报道。NF1功能的失活使RAS蛋白保持在与GTP结合形式中，从而导致RAS蛋白的过度激活。TRK（酪氨酸激酶受体）-KRAS-BRAF-MEK-ERK通路的过度激活可能解释了达拉非尼和曲美替尼对我们患者的有效性。因此，BRAF和MEK抑制剂的疗效可能是由NF1失活引起的，而不是由BRAF突变。不能排除这两种基因的改变都影响了这些药物的疗效。上述p.V600E和p.D594G突变改变的BRAF激酶与达拉非尼分子对接的结果证实，在p.D594G突变存在的情况下，达拉非尼与BRAF激酶的结合能力保持不变。

已有研究表明，NF1突变的肺癌患者大多为男性和吸烟者，而NF1突变的NSCLC患者代表了一种独特的分子和临床亚型的肺腺癌。研究人员使用NGS检测了591例NSCLC患者。在60例（10%）患者中检测到NF1基因突变，在141例（24%）患者中发现了KRAS基因突变。现已鉴定出72种NF1基因变异，其中48种NF1突变（错义、无义和移码）被预测有害。45例患者有独立的NF1突变。在另外15例（25%）病例中，NF1突变与其他癌基因的突变同时发生：BRAF（p.C685S， p.G469V）， ERBB2（p.S310Y，p.V308L）， KRAS (p.G12D，p.G12V， p.G13C，p.G13D）， HRAS（p.Q61H）和NRAS（p.G13R）。

TP53（肿瘤蛋白P53）和STK11/LKB1（丝氨酸/苏氨酸激酶11）是在NF1或KRAS基因突变的肿瘤中发现的最常见的突变抑制基因。此外，与KRAS突变队列（46/132，35%）相比，NF1突变患者发生TP53突变或NF1双等位基因缺失更频繁（33/51，65%）。在本文的患者中，除了已知致病状态的BRAF和NF1突变外，还观察到TP53（p.H179R）、FANCC（p.Q13*）、NOTCH1（p.Y708fs*9）、EPHB1（p.R56L）和TET2（p.N752fs*59）变异。此外，在CDKN2A/B（周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A/B）p16INK4a基因（p.D108G）中发现了一个致病意义未知的变异。这些基因通常被描述为肿瘤抑制因子，尽管在某些情况下这是有争议的。在10%的NSCLC患者中可能存在NOTCH1突变激活，而在30%的NSCLC患者中可以看到NUMB（NOTCH的负调控因子）的表达降低。这提示NOTCH1的表达随组织病理学亚型的不同而存在差异，NOTCH1的过表达与NSCLC的疾病进展和不良预后有关。然而，也有研究表明NOTCH1过表达与抑制淋巴结转移和非小细胞肺癌的进展有关。CDKN2A/B p16INK4a肿瘤抑制基因的突变是描述最好的突变之一，并与许多类型的肿瘤有关。COSMIC数据库显示，该基因的p.D108G变体具有致病性（体系变异）。然而，目前还没有关于这种突变对蛋白质功能影响的报道。密码子D108（D108H，D108Y）的改变会导致周期蛋白依赖性激酶抑制剂的不稳定和细胞周期控制的丧失。

对患者的游离循环肿瘤DNA进行测序，结果证实了前面提到的突变的存在。此外，还发现了TP53基因的另一个突变：c.733G>A（p.Gly245Ser）。在遗传性癌症综合征和李法美尼症候群（Li-Fraumeni syndrome，LFS，李-佛美尼综合症）中，它被描述为具有致病性的胚系变异。然而在肺鳞癌中，TP53被描述为可能具有致病性，并存在体系变异。在肿瘤和液体活检材料中都发现了TP53基因中的c.536A>G（p.His179Arg）变体，这与ClinVar数据库中对致病性的解释之间存在矛盾。大量报道表明，这种突变具有致病性，这种体细胞变异发生在许多癌症中，包括小细胞肺癌和肺鳞癌。

有证据表明，与单基因预测相比，共突变可能是治疗反应的更精确的生物标志物。BRAF突变NSCLC患者的分子改变包括以下基因的突变：TP53（53.3%）、STK11（16.2%）、ATM（共济毛细血管失调扩张突变基因）（5.8%）、NF1（6.9%）、PIK3CA（6.6%）、KEAP1（6.6%）、MYC（MYC原癌基因，BHLH转录因子）（10.8%）、NKX2-1（7.3%）。这些数据涉及腺癌，而我们的患者被诊断为疑似肺鳞癌，这种组织学类型的BRAF突变极其罕见（0.3%）。BRAF基因突变在肺鳞癌中出现的频率略高于其他鳞癌。本例患者肺部肿瘤的组织病理学检查不排除肿瘤原发于肺外的可能，肾脏低分化鳞状细胞转移肿瘤的模糊免疫组织化学检查可能表明这一点（p40[+]，p63[+]，CK7[+]， CK5/6[+]，Vimentin[+]，CD10[+/−]，GATA3[−]，Napisn A[−]，CK20[−]，PAX8[−]，TTF1[−]，Ki67/MIB1[80%细胞中+++]）。在原发灶不明的癌症（Cancer of Unknown Primary, CUP）中，免疫组化诊断困难，往往不能明确地回答转移的起源部位。有相关专家研究了252例CUP。对来自最早队列的54例患者进行了回顾性分析，剩余的198例患者在诊断后立即进行了NGS并取得结果。研究人员发现了以下基因突变的存在：TP53（49.6%）、CDKN2A（19.0%）、NOTCH1（14.1%）、KRAS（23.4%）、FGFR4（14.9%）和PIK3CA（10.7%）。在198例患者的亚群中，3.5%的人群存在BRAF突变。

在我们的患者中，我们还在FANCC（FA互补组C）基因的13号密码子处发现了移码突变（C.37c>T，p.Gln13Ter），这是一个终止型的致病性胚系变异。FANCC基因突变与范可尼贫血有关，范可尼贫血是一种染色体不稳定、对DNA交联剂过敏、大量染色体断裂和DNA修复缺陷的疾病。此外，FANCC基因突变的存在增加了遗传性癌症的易感性，也增加了胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌和肺癌的发展风险。有一例55岁的患者，诊断为肺腺癌，经手术切除和化疗治疗后出现结直肠腺癌。息肉切除后，诊断为肾鳞状细胞癌。研究人员打算探寻肿瘤病变的起源。在对这三个肿瘤组织样本进行免疫组化检查后，结果是不确定的，正如本文先前描述的病例。研究人员对三个肿瘤样本中的520个癌症相关基因进行了测序。他们发现，肺癌和肾癌组织的突变与结直肠癌组织非常相似，但也存在不同。根据测序数据，研究人员认为肺癌和结肠癌是原发肿瘤，而肾癌是肺癌的转移的结果。在所有三个癌症样本中都观察到FANCC（FANCC p.W113X）突变，证实为患者淋巴细胞的胚系变异。在病人的儿子身上也发现了相同的FANCC变异，幸运的是，他在检测时身体健康。更重要的是，患者的父亲患有结肠直肠癌，这推动了遗传性癌症综合征的诊断。

FANCC参与基因组稳定的维持，并被认为是一种肿瘤抑制因子。在我们的患者中发现的p.Gln13Ter失活突变是FANCC抑制活性消除的扳机，这可能与疾病的更坏的临床病程有关。此外，FANCC基因突变的患者发生急性髓系白血病（AML）和骨髓增生异常综合征（MDS）的风险增加，这是有据可循的。可以认为，本文患者MDS的发展是由FANCC基因的遗传突变引起的。MDS的最初症状也在患者的女儿身上出现，而她目前还没有进行基因检测。

总结

在本文描述的临床病例中，肿瘤抑制因子的失活似乎促进了肿瘤的发展，并可能参与了共病（MDS，骨髓异常增生综合征）的发生发展。尽管这些变异不是明确符合分子靶向治疗的条件，但它们可能与预后较差、疾病进展时间和总生存期缩短有关。BRAF致癌基因和NF1肿瘤抑制基因的突变是使用达拉非尼和曲美替尼治疗的原因。患者在短期内病情稳定。这证明了这些基因的共存突变会影响病程和疗效。必须注意患者的共病，包括MDS——这一病症的出现使治疗变得复杂。在FANCC基因中发现的突变可能提示我们的患者具有癌症和MDS发展的遗传易感性。据了解，范可尼贫血患者罹患骨髓衰竭、MDS、白血病、头颈部鳞状细胞癌等实体瘤的风险非常高。该患者经历了与MDS病程相关的恶化，尽管患者在接受了达拉非尼和曲美替尼治疗后，肿瘤明显缩小，遗憾的是，患者最终死亡。

参考文献：

Grenda, A.; Krawczyk, P.; Targowska-Duda, K.M.; Kieszko, R.; Paśnik, I.; Milanowski, J. Efficacy of Dabrafenib and Trametinib in a Patient with Squamous-Cell Carcinoma, with Mutation p.D594G in BRAF and p.R461* in NF1 Genes—A Case Report with Literature Review. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 1195. https://doi.org/10.3390/ijms24021195