本研究对33名消化道肿瘤患者的腹水和腹腔冲洗液细胞学样本进行了NGS检测，同组织样本检出的基因突变进行了比较，发现细胞学样本和组织样本检出基因突变的总体一致性为25%。肿瘤细胞含量>2%的细胞学样本可检出致病性突变，敏感性为69.2%。胰腺癌患者腹水样本分别有33%、13%和7%的KRAS、TP53和CDH1突变阳性，胃癌患者腹水样本分别有25%、12%和13%的KRAS、TP53以及APC突变阳性。
研究背景
对于肿瘤患者，可以通过收集脱落的细胞成分或抽吸法采集样本用于细胞学诊断。腹水和腹腔冲洗液是消化道肿瘤患者细胞学样本的常见来源。腹水是腹腔内液体的异常聚集，可由癌症和其他疾病引起，包括肝硬化、心力衰竭、慢性肾功能衰竭和腹膜感染。对腹水进行细胞学检查可以确定是否存在恶性细胞。向腹腔灌注生理盐水冲洗获得腹腔冲洗液进行细胞学检查可以发现消化道肿瘤患者的隐匿癌细胞。腹膜转移是消化道肿瘤症患者最常见的复发模式和死亡原因，因此腹腔冲洗液细胞学检查对于确定这些患者的肿瘤分期和预测复发非常重要。
细胞学样本容易获取，便于重复采样，但也有缺点。用于细胞学检查的液体样本的缺点包括细胞沉淀少、细胞群的异质性以及肿瘤细胞含量相对较低。来源于腹腔的样本通常含有大量反应性间皮细胞和炎症细胞，导致难以检测到相对较少的肿瘤细胞。腹腔细胞学检查对肿瘤诊断和分型的能力相对较低，诊断敏感性在50-70%之间。一些方法能够提高诊断精确性和敏感性，包括对样本进行特定的肿瘤标志物检测。
恶性肿瘤患者的腹水和腹腔冲洗液样本富含肿瘤蛋白和肿瘤DNA。对来源于肿瘤的DNA进行基因检测可完善细胞学诊断。NGS检测可以分析DNA突变，识别低丰度（AF）的致病性变异。肿瘤患者血液、尿液、渗出液和脑脊液等液体活检样本NGS检测已得到临床应用。细胞学样本NGS检测也显示出临床诊断价值，包括评估肿瘤异质性、耐药性以及微小残留病灶。细胞学样本中来源于肿瘤的DNA的数量和类型不同。对腹水和腹腔冲洗液细胞学样本进行NGS检测可以完善病理学诊断。
本研究假设，消化道肿瘤患者腹水和腹腔冲洗液细胞学样本NGS检测可完善消化道肿瘤诊断。本研究中，对患者腹水和腹腔冲洗液样本进行了NGS检测，以探索细胞学检查显示恶性、疑似恶性和良性的肿瘤患者的基因组特征。比较了细胞学样本和肿瘤组织样本中检出的基因突变，以及患者临床病理特征。最后，本研究评估了消化道肿瘤患者腹水和腹腔冲洗液细胞学样本NGS检测基因突变可行性。
研究方法
对2018年1月至2020年12月间33名患者的腹水和腹腔冲洗液样本进行了分析。这33名患者包括27名癌症患者（13名胰腺癌患者和14名胃癌患者）以及6名非恶性肿瘤患者（如肾衰竭和腹膜炎）。收集了13名胰腺癌患者、8名胃癌患者和6名非恶性肿瘤患者的腹水样本，以及6名胃癌患者的腹腔冲洗液样本。获取了10名癌症患者（2名胰腺癌患者和8名胃癌患者）的配对肿瘤组织样本，对这些样本进行了福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）处理。对腹水和腹腔冲洗液样本在收集后12小时内根据标准方案进行了处理（图1）。细胞学样本随后用于DNA提取和NGS检测，基因列表见表1。
图1. 消化道肿瘤患者腹水和腹腔冲洗液细胞学检查
表1. NGS检测基因
研究结果
患者特征和细胞学诊断
33名患者的基线人口统计学和临床特征如表2所示。这33名患者包括20名男性和13名女性，年龄从39岁到90岁不等。组织样本和细胞学样本采集时间间隔为0至42个月。采集了腹水的胰腺癌和胃癌患者的临床预后较差，而采集了腹腔冲洗液的胃癌患者的预后较好，疾病稳定，随访期间无复发。
表2. 患者详细信息（n=33）
细胞学和组织样本比较分析
对10名接受了手术或活检的患者进行了腹水/腹腔冲洗液样本和FFPE组织样本NGS检测，比较了检出的基因变异（表3）。其中，2名胰腺癌患者和5名胃癌患者采集了腹水样本，另外3名胃癌患者采集了腹腔冲洗液样本（图2）。检测结果显示，3名患者细胞学样本和组织样本检出相同的基因突变。2名胰腺癌患者的组织样本均检出CDH1和TP53突变，腹水样本中也检出CDH1突变。胃癌患者的组织样本检出TP53、APC、RYR2、CTNNB1、KIT、FBN2、TSC2和PIK3CA突变，配对腹水样本中也检出TP53和APC突变。仅在腹水样本中检出KRAS突变。胰腺癌患者的组织样本检出TP53、KRAS、CREBBP和PIK3CA突变。1名胰腺癌患者（PC1）的原发肿瘤组织样本和细胞学样本检出有相同基因突变频率高，在细胞学样本和配对组织样本中，致病性CDH突变丰度（AF）分别为4.6%和54.1%。腹腔冲洗液样本未检出突变。细胞学样本和组织样本检出体细胞突变的总体一致性为25%（细胞学样本敏感性21.43%，特异性50.00%）。
表3. 细胞学和组织样本NGS检测结果比较（n=10）
图2. 腹水/腹腔冲洗液细胞学样本和组织样本基因突变检测结果比较
细胞学样本NGS检测结果
表4显示了腹水/腹腔冲洗液细胞学样本的NGS检测结果。13例胰腺癌患者腹水细胞学检查显示，4例为非典型性，3例为疑似恶性，6例为恶性。细胞学样本中肿瘤细胞的百分比为0.1-10%。8例胃癌患者腹水细胞学检查显示均为恶性。细胞学样本中肿瘤细胞的百分比为5-10%。6例胃癌患者腹腔冲洗液细胞学检查显示，1例为非典型性，1例为疑似恶性，1例为恶性，3例为阴性。细胞学样本中肿瘤细胞的百分比为0%-1%。从6例非恶性肿瘤患者中获取了腹水作为对照样本，这些患者均携带良性变异，被视为野生型。对6名胃癌患者的腹腔冲洗液样本和6名非恶性肿瘤患者的腹水样本进行了NGS检测，均未显示突变。总体肿瘤细胞含量为~0-10%。为了确定肿瘤细胞含量为多少时NGS检测可检出突变，通过生成ROC曲线得出最低肿瘤细胞含量最优阈值为2%，曲线下面积（AUC）为0.833（p<0.001；图3）。重要的是，肿瘤细胞含量>2%的细胞学样本可以检出致病性突变，敏感性为69.2%（9/13）。
表4. 腹水和腹腔冲洗液细胞学样本NGS检测结果（n=33）
图3. 通过ROC曲线确定样本检出突变所需肿瘤细胞含量
腹水细胞学样本NGS检测结果如图4所示。在胰腺癌患者的腹水样本中，分别有33%、13%和7%的KRAS、TP53和CDH1突变阳性。类似地，胃癌患者腹水样本中分别有25%、12%和13%的KRAS、TP53和APC突变阳性。
图4. 胰腺癌和胃癌患者腹水样本检出的基因突变
讨论
使用靶向药物需要对患者进行基因分型，选择可能对治疗有反应的患者。使用NGS检测进行基因分型可以确定癌症患者的治疗方案并预测预后。用于基因分型的NGS检测需要一定量的肿瘤DNA。然而，由于肿瘤位置、肿瘤扩散风险以及活检或手术过程中的并发症，从一些患者身上获取肿瘤组织样本可能不可行。液体活检对非固体生物组织取样，如血液和体液（如尿液、唾液、腹水或渗出液）。液体活检是组织活检的非侵入性替代方法，并可以对癌症演化进行纵向评估。细胞学样本是常规的液体活检之一。细胞学样本容易获取，便于重复采样，可以替代组织样本，用于评估癌症患者当前状态。细胞学样本或液体活检样本中提取的DNA可以用于分子检测，从而避免额外的组织活检。细胞学样本可以用于基因检测和辅助诊断。
本研究评估了消化道肿瘤患者腹水和腹腔冲洗液细胞学样本检测基因突变的可行性。通过比较细胞学样本和配对肿瘤组织样本检出的体细胞突变来确定细胞学样本的诊断价值。细胞学样本和组织样本检出突变的总体一致性为25%，细胞学样本敏感性为21.43%，特异性为50%。腹水样本和组织样本的一致性为27%，而腹腔冲洗液样本和组织样本的一致性为0%。原发肿瘤组织样本中突变频率高的基因在细胞学样本中突变检出率也高，一名患者（PC1）腹水样本中致病性CDH突变AF为4.6%，肿瘤组织样本中为54.1%。比较了33例患者（27例消化道肿瘤，6例非恶性肿瘤）的基因分型结果和肿瘤细胞含量以及细胞学诊断。腹水/腹腔冲洗液样本中的肿瘤细胞含量为0-10%，可以检出体细胞突变的肿瘤细胞含量最优阈值为2%。值得注意的是，肿瘤细胞含量>2%的腹水/腹腔冲洗液样本可检出致病性突变，敏感性为69.2%。
腹水/腹腔冲洗液样本中肿瘤细胞含量与体细胞突变检出情况之间的关系可能受到这些样本中大量间皮细胞和炎症细胞的影响。利用肿瘤细胞含量阈值可以提高诊断敏感性。原发性肿瘤组织样本中基因突变频率高，腹水/腹腔冲洗液样本中突变DNA含量也高，因此突变负荷高的原发性肿瘤可用于细胞分子学评估。对2名胰腺癌患者的FFPE细胞块，以及3名胃癌患者和1名结肠癌患者的腹水上清液进行了NGS检测，结果与组织样本一致。其他研究中，患者进行了腹水游离DNA（cfNDA）检测，在卵巢癌和肺癌患者的样本中检出TP53、EGFR、ALK、BRAF突变。
据我们所知，迄今为止还没有研究评估腹腔冲洗液细胞学样本的NGS检测结果。在本研究中，所有腹腔冲洗液细胞学样本NGS检测结果均显示野生型，与肿瘤分期和大小无关，表明这些样本基因突变检测结果受非常低的肿瘤细胞含量的限制。与此相比，肺癌患者的胸腔积液样本NGS检测具有诊断和预后价值。这些发现表明，癌种、样本类型、样本中肿瘤细胞含量及原发灶基因突变状态均可能影响细胞学样本的基因检测结果。
细胞学诊断常常会有不明确的结果，如非典型性。对于不确定的结果，可能需要重复采样，以及结合临床特征和影像学结果来明确诊断。NGS检测可以辅助诊断结果不明确的患者，如非典型性。一名先前诊断为非典型性的患者（PC1）的腹水样本中检测到体细胞突变，该患者腹水样本肿瘤细胞含量为0.1%。细胞学诊断结果取决于样本肿瘤细胞含量。肿瘤细胞含量很低（~0.1–0.5%）的患者判为非典型性，而肿瘤细胞含量较低（~1–2%）的患者则判为疑似恶性。细胞学样本的肿瘤细胞含量也影响消化道肿瘤患者体细胞突变检测结果。因此，NGS检测在完善腹水/腹腔冲洗液样本细胞学诊断方面受限制。不过，NGS检测基因突变可以减少假阳性结果，因为在非恶性肿瘤患者的所有腹水样本基因突变检测结果均为野生型，因此排除了恶性肿瘤的可能性。
NGS检测结果显示，胰腺癌患者腹水样本分别有33%、13%和7%的KRAS、TP53和CDH1突变阳性，胃癌患者腹水样本分别有25%、12%和13%的KRAS、TP53以及APC突变阳性。由于消化道和肝胆管肿瘤中存在相似的基因突变，胰腺癌和胃癌患者没有表现出明显的分子差异。基于细胞学的NGS检测结果不能确定消化道肿瘤细胞的来源，但可以反映肿瘤动态。有趣的是，在一名胃癌患者（GC3）的腹水样本中检测到一个原发肿瘤组织样本中没检出的KRAS突变。基于细胞学样本的NGS检测可以反映当前的基因突变状态和耐药情况，辅助预后评估和疾病管理。
本研究有几个局限。由于患者数量较少，关于消化道肿瘤患者腹水和腹腔冲洗液样本NGS检测有效性的结论不够明确。在这项回顾性研究中，细胞学样本冷冻保存可能会影响突变检测结果。此外，术后随访期间发现腹水增加通常是复发的证据。在本研究中，收集配对的细胞学和组织样本之间的时间间隔为0-42个月，这可以解释样本检测结果的不同。由于腹腔内有反应性间皮细胞，腹水和腹腔冲洗液中细胞沉淀少，大多数样本中肿瘤细胞含量占比小于2%。假阴性结果限制了细胞学样本用于基因突变检测和预测复发的可行性。对细胞学样本进行NGS检测可以为消化道肿瘤患者提供额外的信息，但需结合临床特征和影像学结果。
据我们所知，本研究首次评估了消化道肿瘤患者腹水和腹腔冲洗液细胞学样本检测基因突变的可行性。根据基因突变情况可以预测肿瘤复发和患者预后，以及确定治疗方案。各种液体活检样本，包括渗出液、脱落细胞和冲洗液样本，以及各种制剂，包括细胞颗粒、细胞上清液和细胞块，可用于消化道肿瘤患者的分子评估。为了评估腹水细胞学样本NGS检测的临床可行性，需要对更多有腹水的患者进行前瞻性研究。
参考文献：
Bae GE, Kim SH, Choi MK, Kim JM, Yeo MK. Targeted Sequencing of Ascites and Peritoneal Washing Fluid of Patients With Gastrointestinal Cancers and Their Clinical Applications and Limitations. Front Oncol. 2021 Jul 15;11:712754. doi: 10.3389/fonc.2021.712754. PMID: 34336700; PMCID: PMC8319747.