BRAF非V600突变是结直肠癌（CRC）的一个独特分子亚群，与BRAF V600突变几乎没有临床相似性。目前普遍认为BRAF非V600突变与CRC患者较好的生存率相关。本文报道了1例初诊为IIIC期结肠癌中年女性患者，在根治性手术后25个月发现多发转移。下一代测序（NGS）结果显示BRAF p.N581I（c.1742A>T）突变。患者接受了化疗、靶向治疗和免疫治疗。然而，疾病进展迅速，伴罕见的骨和小脑转移。该病例强调了BRAF非V600突变（如BRAF p.N581I突变），可能导致对表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂的耐药，加快CRC患者病程。BRAF p.N581I突变在CRC中的作用有待进一步研究。
背 景
结直肠癌（CRC）是全球第三大癌症，转移病变是其主要死亡原因。CRC可根据其分子特征分为不同的亚型。其中，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活是参与CRC发生的重要通路之一，主要包括Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）、V-RAF鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1（BRAF）、丝裂原活化蛋白（MEK）等。约10%的CRC患者发生BRAF突变，其中大多数均为V600E突变，即第15外显子T1799A突变。携带BRAF非V600突变的患者数量较少，限制了对其进一步的了解。BRAF非V600突变的临床关联、基因相互作用和治疗意义尚未得到深入研究。本文报告了1例转移性结肠癌女性患者，该患者携带体细胞BRAF p.N581I突变，对EGFR抑制剂联合化疗耐药，导致疾病快速进展。这种快速进展超出了既往对BRAF非V600突变研究的认知范围。本文就BRAF非V600突变在CRC中的研究现状进行讨论。
病 例
患者女，41岁，因腹痛、腹胀伴肛门止便、排气5天，于2018年11月27日到苏州市立医院肿瘤科就诊。腹部增强计算机断层扫描（CT）显示结肠扩张、积液和气液平，考虑肠梗阻的可能性（图1A，B）。电子结肠镜检查显示结肠内有一个菜花状肿块，位于距肛缘约70 cm处（图1C）。病变完全阻塞肠腔，内镜无法通过。快速病理检查显示腺癌。癌胚抗原（CEA） 15.77 ng/mol。患者于2018年12月24日接受乙状结肠肿瘤全切除术。术后病理显示为低分化腺癌（pT4aN2M0，图2A）。肿瘤直径约为4 cm。肿瘤浸润整个肠壁，浆膜外纤维脂肪组织堆积。同时发现8个肠系膜淋巴结转移。免疫组织化学（IHC）检测结果如下（图2B）：微卫星稳定/错配修复完整（MSS/pMMR）、MLH1（+）、MSH2（+）、MSH6（+）、PSM2（+）、KI67（60%）、CDX2（+）、ER（−）和波形蛋白（−）。从2018年12月12日至2019年4月10日患者进行了6个周期的辅助化疗（XELOX：奥沙利铂，130 mg/m²，第1天；卡培他滨，1000mg /m²，每日2次，第1-14天，口服）。术后辅助化疗后，患者在门诊随访，每6个月进行复查CT扫描。体格检查及生命体征均在正常范围1年余。最后一次结肠镜检查是在2020年8月进行的，也未发现异常（图3A）。
图1（A， B）患者术前CT扫描图像（2018.11）。腹部增强CT扫描显示结肠扩张和气液平。（C）电子结肠镜检查提示结肠有一个大菜花状肿块，位于距肛缘约70cm处。病变完全阻塞了结肠腔。
图2 结肠肿瘤组织标本进行苏木精-伊红染色（H&E）和IHC染色。（A）活检结果为低分化腺癌，部分为黏液腺癌。（B）肿瘤向外纤维脂肪组织浸润整个肠壁。
图3 姑息治疗过程中影像学CT成像显示转移性病灶。（A）结肠镜检查未发现异常（2020.08）。（B）术后2年以后影像学检查（2021.02）。肝脏多发转移灶。（C）PD-L1 IHC提示PD-L1表达为2%。（D）FOLFIRI联合西妥昔单抗治疗4个周期后，CT扫描显示肝转移灶明显增大（2021.04）。（E）FOLFIRI联合贝伐珠单抗治疗5个周期后，复查颅脑MRI扫描显示右侧颅骨新发异常高密度影，考虑转移（2021.06）。（F， G）mFOLFOX6联合姑息性放疗治疗2个月后，CT显示肝脏转移灶与既往相似，颅脑MRI提示小脑转移（2021.09）。（H）患者末次复查CT显示肝转移再次进展（2021.12）。
2021年2月复查腹部CT提示多发肝转移，肾上腺也有转移，伴腹膜后淋巴结肿大（图3B）。CT评估为疾病进展（PD）。患者接受FOLFIRI一线姑息化疗（伊立替康240 mg第1天，亚叶酸钙500 mg第1天，5-氟尿嘧啶500 mg第1天静脉推注，之后3000 mg 46h静脉持续输注，每2周1次）。使用2021年2月采集的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和血液循环肿瘤DNA（ctDNA）进行NGS分析。FFPE样本中检测到的基因突变和突变丰度如下：TP53p.E298*（37.52%）、APC p.Q1429*（33.35%）、RAF1p.R391W（23.56%）、BRAFp.N581I（22.65%）、KMT2C p.N2587*fs*1（19.82%）、EphA5p.R896H（12.65%）、B2Mp.M1T（4.47%）和MYC基因拷贝数增加（n=3.61）。外周血ctDNA样本中检测的基因突变和突变丰度如下：TP53p.E298*（27.58%）、APCp.Q1429*（45.95%）、RAF1p.R391W（25.58%）、BRAFp.N581I（22.15%）、KMT2C p.N2587*fs*1（18.13%）和STK11拷贝数丢失（n=1.1）。NRAS/KRAS基因均为野生型。详细测序结果见表S1。PD-L1表达为2%（CPS，图3C）。因此，在治疗方案中加入西妥昔单抗（800 mg）。4个周期后，由于肝转移灶增大，根据RECIST 1.1版，影像学评估显示PD（图3D）。患者于2021年4月接受FOLFIRI +贝伐珠单抗二线治疗（伊立替康240 mg第1天，亚叶酸钙500 mg第1天，5-氟尿嘧啶500 mg第1天静脉推注，之后3000 mg 46h静脉持续输注，每2周1次，贝伐珠单抗300 mg第1天，每2周1次）。5个周期后磁共振成像（MRI）显示颅骨内出现新的转移灶（图3E）。
表S1 FFPE及ctDNA NGS检测结果。
因治疗失败，于2021年6月改用mFOLFOX6方案（奥沙利铂120 mg第1天，亚叶酸钙500 mg第1天，5-氟尿嘧啶500 mg第1天静脉推注，之后3000 mg 46h静脉持续输注，每2周1次），并继续原剂量贝伐珠单抗治疗。期间患者因骨转移接受了短疗程姑息性放疗（30 Gy，10次）和双膦酸盐（唑来膦酸）治疗。患者出现皮质醇升高、高血压等不良反应，经用药后均好转。2个月后，肝转移似乎没有明显增加，但随访MRI显示小脑转移灶（图3F，G）。患者随后接受了4个周期的瑞戈非尼（80 mg）联合信迪利单抗（200 mg）治疗。患者于2021年11月25日接受最后一次治疗，后因肝功能异常暂停治疗。2021年12月21日，患者最后一次在我院的腹部CT检查显示，肝脏病变再次增大（图3H）。此后，患者再未返回医院。图4显示了患者的病程。
图4 患者的病程
讨 论
在转移性CRC（mCRC）中，BRAF V600突变的发生率为5%-9%，而BRAF非V600突变估计仅为1-2%。BRAF突变可基于信号通路机制和激酶活性分为三类。1类BRAF突变为非RAS依赖型单体，具有高BRAF激酶活性，涉及密码子600（如p.V600E/K/D/R/M等）。2类BRAF突变为非RAS依赖型二聚体，具有中等或高BRAF激酶活性，涉及600以外的密码子（如p.K601E/N/Q、p.L597Q/R/S、p.G469A/R/V和p.G464A/R/V）。1类和2类BRAF突变在很大程度上独立于其上游调节因子RAS GTPase，以促进肿瘤的生长和增殖。3类为RAS依赖型二聚体，BRAF激酶活性受损（如p.G466A/E/R/V、p.N581I/K/S/Y、p.D594A/E/G/H/N/V和p.G596R/C等）。其比野生型BRAF与RAS-GTP结合更紧密，导致ERK信号传导增加。
BRAF非V600突变型CRC患者的临床特点主要为：常见于男性、年轻、分化良好、淋巴结阴性、左半结肠，很少出现高度微卫星不稳定性/错配修复缺陷（MSI-H/dMMR）。观察到BRAF V600和非V600突变型mCRC患者的预后不同，BRAF非V600突变型患者的中位OS（mOS）明显较长，为60.7个月，BRAF V600突变型患者为11.4个月，BRAF野生型患者为43.0个月。生存差异表明BRAF非V600突变型mCRC的侵袭性行为较低。据报道，BRAF突变1-3类和BRAF野生型的mOS分别为21.0个月、23.4个月、44.5个月和42.2个月。与3类患者相比，1类和2类BRAF突变型mCRC患者预后较差。3类BRAF突变（如BRAF p.N581I）的预后往往优于BRAF野生型。然而，本文患者在初诊时已发生淋巴结转移，随后发生包括骨在内的大量转移。OS大约为10.0个月，这比既往报告要短得多。
鉴于目前的研究发现，携带3类突变的CRC患者具有总体惰性病程，因此考虑其可能不需要积极的化疗方案（对V600E突变型CRC有益）。目前的RAF抑制剂不太可能在2类或3类突变型CRC中抑制ERK信号传导，因为RAF抑制剂可有效抑制突变单体，但不能抑制二聚体。Yaeger等人开展了一项纳入28例3类BRAF突变患者的回顾性多中心研究，并观察了抗EGFR治疗的疗效。9例携带3类BRAF突变的mCRC患者中有7例在一线或二线治疗中对含有抗EGFR治疗有应答，客观缓解率（ORR）为78%。在三线或后期治疗线中，37%的3类BRAF突变型mCRC患者达到缓解。1例携带BRAF p.N581I突变的患者在一线使用伊立替康和西妥昔单抗联合治疗后被评估为疾病稳定（SD）。无进展生存期（PFS）超过10.3个月。1例携带BRAF p.N581S突变患者在一线接受FOLFIRI和帕尼单抗联合治疗后达到部分缓解（PR），PFS接近达到16.0个月。同样，一线接受FOLFOX联合帕尼单抗治疗的1例BRAF p.N581T突变患者被评估为PR。因此，这些数据表明化疗联合抗EGFR治疗似乎对携带这些突变人群取得了良好效果，尤其是在一线治疗中。然而，本文报道的病例与既往研究结果并不一致。患者在使用西妥昔单抗联合FOLFIRI一线治疗后疾病进展。病程进展迅速，PFS不超过3.0个月。
事实上，3类BRAF突变需要在上游进行二次打击，这可能是RAS突变或EGFR激活。在CRC和肺腺癌中，3类BRAF突变体上游RAS激活的主要机制是受体酪氨酸激酶（RTK）的激活，而在黑色素瘤中则是RAS或NF1变异。因此，阻断上游RAS信号传导是3类BRAF突变CRC患者的潜在治疗策略。基于3类BRAF突变依赖于上游EGFR信号传导，本文患者应该对抗EGFR治疗有应答。BRAF p.N581I突变和其他3类BRAF突变对EGFR抑制剂耐药的原因，在很大程度上是由于这些BRAF突变依赖于RAS，每个上游RAS信号激活都会导致这些突变对抗EGFR治疗产生耐药性。
该患者在一线治疗失败后，在后续治疗中出现多重耐药。在二线治疗中，选择靶向血管内皮生长因子受体（VEGFR）的贝伐珠单抗联合mFOLFOX6化疗。然而，患者并未从中获益，PFS仍然<3.0个月。根据REGONIVO研究，MSS转移性CRC患者在标准化疗后疾病进展，使用纳武利尤单抗联合瑞戈非尼治疗后，ORR为33%，中位PFS为7.9个月。因此本文患者使用信迪利单抗联合瑞戈非尼作为后期治疗选择。然而，即使多靶点抑制剂瑞戈非尼（靶向BRAF、VEGFR1-3、v-kit Hardy-Zuckerman4 猫科肉瘤病毒致癌基因同源物（KIT）和血小板衍生生长因子受体β（PDGFRB）等多个靶点），也未能控制患者疾病进展，未能增强免疫治疗的效果。患者OS仅约为10.0个月。这种低存活率表明BRAF p.N581I突变的恶性程度非常高。
EphA5属于RTKs家族，参与RAS-MAPK信号通路。EphA5突变可能激活RAS导致对EGFR抑制剂耐药。患者FFPE的NGS分析显示EphA5 p.R896H突变，可能导致RAS-GTP水平升高，MAPK信号通路扩增，参与多重耐药。据报道，抗EGFR治疗对患者这种为黏液腺癌的病理类型的临床益处逐渐减少，也导致西妥昔单抗治疗失败。从ctDNA样本中检测出STK11拷贝数丢失。在BRAF p.N581I突变的背景下，其可能激活PI3K通路，正如在BRAF p.V600E突变的黑色素瘤细胞中发现的那样。
可考虑使用MEK/ERK抑制剂联合治疗。1例携带BRAF p.N581S突变的肺癌患者对抗EGFR治疗具有耐药性，改用达拉非尼联合曲美替尼治疗后，PR维持超过33个月。此外，一项I期多中心试验报告了BRAF非V600突变患者使用ERK1/2抑制剂Ulixertinib（优立替尼）（BVD- 523）后，肿瘤体积缩小。该试验显示了在NRAS/BRAF V600/非V600突变的恶性实体瘤中具有活性的早期证据。然而，未来还需要更多的验证。
总之，本文报告了1例携带BRAF p.N581I突变型mCRC患者的罕见病例。患者对抗EGFR治疗、抗VEGFR治疗及常规化疗均有耐药，与既往对3类BRAF突变的治疗认知不一致。快速进展和大量转移表明，不能简单地将3类BRAF突变视为预后良好的类型，全面的基因谱分析对于癌症治疗至关重要。BRAF不同位点的突变可能对蛋白质功能产生不同的影响，了解与特定突变相关的功能变化对于选择适当的治疗策略极其重要。随着NGS技术在临床的广泛应用，越来越多的罕见突变将被检出。希望本文分享的临床经验对类似患者有益，对个体化治疗决策有所帮助。本病例的不足之处在于未进行实时NGS分析，导致患者PD的ctDNA信息不明确。可能还有其他基因突变导致了随后的耐药及骨和小脑的远处转移。
参考文献：Wang X, Zhao C, Gong Y, Wang Y and Guo F (2023) Multidrug resistance in the standardized treatment of colon cancer harboring a rare fibrosarcoma B-type (BRAF) p.N581I mutation: a case report. Front. Oncol. 13:1175693. doi: 10.3389/fonc.2023.1175693