多原发恶性肿瘤(MPMs)是指两个或多个肿瘤发展在不同的位置，或在同一器官内的不同病灶。虽然他们表现出相似的组织学亚分型，但每个肿瘤都有不同的临床特征。多原发恶性肿瘤占所有癌症的6.3%，其2%至17%的患者将发展至少两个原发肿瘤，而第三或第四个恶性肿瘤的确诊概率通常在0.5%至5%之间，第一、二个肿瘤之间的发展时间平均为4年。
如果同时发现两个或两个以上的肿瘤，则将多原发性恶性肿瘤定义为同时发生；如果在6个月内相互检测到肿瘤，则为同步发生；如果在每次诊断之间超过6个月，则为异时发生。最常见的受累器官是鼻咽、肺、结肠和乳房。特别是早期肺癌患者经过治疗后，肺部可能发展出第二种癌症，其次是结直肠癌和膀胱癌。接受激素治疗的乳腺癌女性可能会发展子宫内膜癌、胃癌、结肠癌和卵巢癌；接受放疗的前列腺癌男性增加了患膀胱和小肠肿瘤的风险。
关于最初确诊为胃恶性肿瘤的患者发生第二或第三个肿瘤风险的相关数据有限。Takeuchi 及其同事的一项研究回顾性报道了在胃腺癌患者中，可能有其它肿瘤发生在小肠(最常见的部位)，其次是前列腺和肺。最近一组对葡萄牙胃癌患者的分析表明，第二个肿瘤的最常见发展部位是大肠和小肠，其次是生殖道、呼吸器官和胸腔内器官。
NGS的出现使得数百万个小核酸片段得以进行大规模并行测序，从而鉴定肿瘤样本中独特的遗传标志。事实上，NGS可以识别单/多核苷酸变异、小插入、大插入、缺失、拷贝数变异以及融合变异。在这份报告中，我们讨论了在两年内确诊低分化胃腺癌和左结肠癌的男性患者的临床结果和随后的分子特征。虽然第二个肿瘤最初被解释为胃癌复发，但通过NGS分析后可将其归为两种不同的恶性肿瘤。
病 例
2003年6月，一名40岁男子，有一型糖尿病和肺结核病既往史，因药物治疗上腹痛无效，转入我院。他的胃镜检查显示胃后壁有一个巨大的突出溃疡性肿块；内镜活检发现了在坏死组织背景下的低分化胃腺癌。病人的CA19-9轻度升高，术前分期CT检查证实了胃后壁有较大的肿瘤伴淋巴结肿大，在无远处转移的情况下，他接受了全胃切除。然而在切除胃结肠韧带后，发现癌症灶与胰体、胰尾相邻，分界面不清晰，因此我们行了胰腺远端和脾的整块切除以及D2胃淋巴结清扫。术后患者病程平稳，于九日后出院，身体状况良好。
最终的病理检查证实了恶性上皮肿瘤的存在，基于这些形态学特征可确诊为“胃低分化管状(实体)腺癌”，患者分期为pT4b N1。鉴于根治性手术切除和现有化疗方案益处有限，肿瘤咨询学家并未给出辅助治疗的指示，患者开始了他指定的随访计划，疾病未再复发。
然而，两年后他发生了肠梗阻，对其进行紧急剖腹探查，发现左结肠有一个狭窄的癌症灶，附着在肾上极和横膈膜。患者做了包括左肾上极和部分膈肌在内的左半结肠肿瘤整块切除。基于形态特征，患者被确诊为“高级别(低分化)肠型腺癌”。肿瘤浸润结肠壁的整个厚度，穿透浆膜，此外切除的肾实质和膈肌也有浸润。由于共发现12个结肠周围淋巴结转移，最终确定病理分期为pT4b N2b。
通过家族史排除了这两种癌症是遗传性胃癌或结肠肿瘤的可能后，对该病例进行多学科评估，表明第二个癌症可能是两年前胃肿瘤的转移。患者接受了12周期的De Gramont方案辅助治疗，并再次被分配随访计划。迄今为止病人的健康状况良好，没有复发迹象。
NGS揭示两种独立恶性肿瘤的可能
鉴于该病例的特殊性，我们决定通过靶向NGS分析研究这两种肿瘤的分子分型，以确定第二个肠腺癌与第一个胃腺癌是否具有相同的遗传变异。测序数据显示两种肿瘤之间具有不同的突变模式：胃腺癌在7个与癌症相关的基因上显示出8个单核苷酸变异(SNV)，其中3个与结肠腺癌相同，而第二个肿瘤中未发现其他特异性变异(表1)。
表1 两种腺癌中检测到的8个单核苷酸变异及其功能特性Ref:参考等位基因；Alt:替代等位基因；AF:等位基因频率
两个肿瘤3处共同突变的所在基因：血小板源性生长因子受体α (PDGFRA)基因、调节WNT信号通路的APC蛋白基因(APC)和肿瘤蛋白P53基因(TP53)，因其AF为约50%或100%，我们猜测它们可能是以杂合子(50%)或纯合子(100%)表达的胚系变体。事实上，另外从患者血液中获得的基因组DNA的NGS分析，证实了这三种变异为胚系变异，其中两种为纯合子（PDGFRA P567= 和APC T1493=，AF均为100%），而TP53 P72R是杂合突变（AF为 53.90%）（表1）。未再发现其他胚系变异。
两种肿瘤的不同变异模式表明它们是不同时间发展的不同原发肿瘤，因此该病例归类为异时性MPM。为了确认先前是否描述过这些变异，我们利用dbSNP和ClinVar数据库的数据来进行推断。此外，我们运用了不同预测工具（PhyloP, SIFT等七种工具）所生成的信息来评估这些变异的可能影响（表2）。
表2 突变效果的预测
两个数据库中报道的信息+用7种预测工具获得的胚系变异数据A+第一个胃腺癌中检测到的体系变异数据B
关于胚系变异，其中两个是同义突变(PDGFRA P567= 和APC T1493=) ，在ClinVar中报道为良性。相反，TP53 P72R错义突变是一种常见的多态性，在ClinVar中被报道为“药物反应”，并且大部分被预测为中性（表2A）。
在胃肿瘤特异性变异中，有四个错义突变和一个同义突变，所有这些突变的 AF<10% （表1和表2B）。PIK3CA基因第一外显子上的R108H突变似乎对蛋白质功能有破坏性影响，它是一种罕见的突变，曾在少数胃癌病例中报道过。此外，Harada等人报道PIK3CA的突变与胃癌患者的预后无关。IDH2的上R140Q 的替换是最常见的 IDH2突变之一，但它主要与急性骨髓性白血病相关，从未在胃癌中报道过。E-钙粘蛋白(CDH1)基因上的胚系变异通常与遗传性弥漫性胃癌(HDGC)有关，但在这个例子中，我们发现了一种以前从未报道过的体系变异D370N，它似乎具有破坏性作用。胃肿瘤的最后两个特异性变异，TP53 H297=和SMAD4 S144L变异，未在COSMIC数据库中报道 (表1）。尽管在ClinVar中报道了TP53上的H297=同义突变“可能是良性的”，预测具有“中性”效应或“多态性”，但对于SMAD4S144L 错义突变无从查起。但正如我们预期的那样，几乎所有用来检测SMAD4S144L变异的工具都预测出有害的结果，因为单个氨基酸的替换很可能改变蛋白质的结构或功能，而之前并没有任何关于这种突变的报道。
以上结果表明，胃癌和结肠腺癌可能是两种不同的原发恶性肿瘤，不同的分子特征或许能说明第一个胃癌的基因组有更大的不稳定性。此外，在我们的分析中发现胚系和体系变异似乎对促进两种肿瘤的发生发展具有意义。最后，第一个胃癌的所有特异性体系变异都有较低的AF(约 7% -表 1)，怀疑这对肿瘤起到致病性发病机制的作用。因此，它们的临床相关性需要进一步评估。
结 果
异时性 MPMs 需要确认每个肿瘤的原发性，并严格排除所有肿瘤的转移可能性。这里我们报告了一名男子在两年内患上两种癌症，其中第二种最初被解释为第一种癌症的转移。之后随着NGS分析的出现，两种肿瘤的变异特征表明它们是不同的散发恶性肿瘤，因此该病例可以确诊为MPM。
本报告强调了NGS分析对于正确诊断人类疾病的重要性，对整个人类基因组或癌症相关基因的测序，或许能够识别在形态学上无法区分的不同肿瘤疾病的特定改变。此外，肿瘤细胞的基因检测可以识别与疾病预后相关的基因改变，从而为肿瘤的治疗提供有用的信息。最后强调的是，鉴定特定的基因突变可能有助于分子靶向治疗的选择并制定个性化治疗方案，否则就无法靶向治疗癌症。由于预测工具显示，上述患者检测到的变异中，并没有哪个变异能明确导致两种癌症的发展，因此临床结果异常良好的原因必须从其他方面考虑。总之，尽管导致同一患者两年内诊出两种癌症的遗传决定因素尚不清楚，但NGS分析极大地帮助了对两种肿瘤不同原发性的确诊。
参考文献：
Romano C, Di Gregorio S, Pennisi MS, Tirrò E, Broggi G, Caltabiano R, Manzella L, Ruggieri M, Vigneri P, Di Cataldo A. Multiple primary malignances managed with surgical excision: a case report with next generation sequencing analysis. Mol Biol Rep. 2022 Jun 17. doi: 10.1007/s11033-022-07630-8. Epub ahead of print. PMID: 35715605.