2021 WHO分类建议胶质瘤患者检测分子变异，NGS vs IHC怎么选？

图1. 根据WHO CNS5 2021，基于分子特征的星形细胞瘤分级。在IDH突变型星形细胞瘤中，CDKN2A纯合缺失，是恶性级别最高的标志物。在IDH野生型弥漫性星形细胞瘤中，如果存在TERT启动子突变、EGFR扩增、7号染色体获得伴10号染色体缺失（+7/-10）这三个分子指标中的一个或多个，则为WHO CNS5最高级，归为胶质母细胞瘤。目前分类中不存在IDH突变型胶质母细胞瘤。

根据分子特征，可以使用多种分子检测方法，例如荧光原位杂交（FISH），定量聚合酶链反应（qPCR）包括甲基化特异性聚合酶链式反应（MS-PCR），以及包括拷贝数变异（CNV）的NGS检测。分子技术的分辨率、灵敏度和特异性各不相同。NGS和qPCR的检测下限（LOD）取决于流程和基因变异的类型。通常，qPCR的LOD在1%到5%之间，NGS在5%到10%之间；不过，NGS和qPCR的LOD不完全一致，通常分别在1%到10%和2%到15%之间变化。Sanger测序可以检测频率在15-20%及以上的基因变异。选择合适的方法进行分子检测非常重要。免疫组化（IHC）利用突变特异性单克隆抗体检测突变蛋白，已被纳入IDH1/2点突变标准筛查方法。尽管NGS检测单个样本的成本显著高于其他方法，但由于NGS能够实现全面检测，在不久的将来，包括CNV的NGS将取代FISH、qPCR、Sanger测序或IHC等方法。

考虑到最新的诊断建议，以及临床管理中分子标志物越来越多，也越来越重要，本研究探索了NGS是否为能够同时检测胶质瘤多个分子标志物的主要方法。此外，比较了NGS和IHC检测IDH1/2状态的情况（根据WHO CNS5）。

研究方法

对2017年1月至2021年6月期间到比得哥什癌症中心就诊的86例胶质瘤病例进行了回顾性分析。患者在外院进行了组织病理学检查和IHC检测，没有进行胶质瘤NGS检测。年龄、性别、既往放化疗治疗史以及分子检测结果等数据来自我中心。对34名患者的样本进行了NGS检测。NGS检测纳入标准为：诊断为胶质瘤的患者；组织样本（与用于组织病理学检查的相同）质量合格。排除标准如下：缺乏组织样本或双链DNA（dsDNA）的质量和数量不足以进行NGS检测。在进行NGS检测的34例胶质瘤中，17例先前在外院使用IHC或多重连接依赖性探针扩增（MLPA）检测了IDH1/2状态（图2）。

图2. 流程

样本肿瘤细胞含量为5%到95%。从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）脑肿瘤组织样本中提取了DNA。使用实时聚合酶链反应（PCR）片段定量分析（FQA）CE-IVD和/或荧光法评估了DNA的质量和数量。

NGS panel（CE-IVD）覆盖16个基因的热点区域：BRAF、EGFR、ERBB2、HRAS、C-KIT、IDH1、IDH2、JAK2、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、RET、TERT启动子区域以及TP53整个外显子。

对所有IHC或MLPA检测了IDH1/2状态的样本进行了qPCR和Sanger测序，以解决不同方法之间的判定差异，确定IDH1/2基因分型。

通过NGS检测了拷贝数变异，看是否存在CDKN2A纯合缺失。

研究结果

致病性和疑似致病性变异发生频率

使用从34例胶质瘤患者样本中提取的DNA进行了NGS检测。TERT启动子致病性变异发生频率最高（23/34，67.6%），19/23存在NC_000005.9:g.1295228G>A（通常称为C228T），4/23存在NC_000005.9:g.1295250G>A（C250T）。C250T和C228T变异相互排斥。TERT启动子致病性变异在少突胶质细胞瘤中发生频率最高（4/5，80%），其次是胶质母细胞瘤（13/18，72%）。IDH1/2致病性变异发生频率第二高（13/34，38.2%），其次是TP53致病性变异（11/34，32.3%）和PIK3CA致病性变异（3/34，8.8%）（见图3）。图4显示了共同存在的致病性变异。可以注意到，EGFR致病性变异在任何情况下都不会与IDH1/2致病性变异共存。此外，IDH1/2致病性变异体通常与TP53致病性变异共存。NGS检测到的最常见的致病性变异示例见图5。

图3. 胶质瘤基因变异频谱和患者临床特征

图4. 患者共突变情况

图5. NGS检测到的最常见的致病性变

比较IHC或MLPA与NGS、qPCR、Sanger测序检测IDH1/2状态

先前外院使用IHC检测了13例患者样本的IDH1/2状态，使用MLPA检测了4例。外院用于IHC或MLPA检测的相同FFPE样本用于我院NGS检测。

根据外院IHC检测报告，4个样本被归为IDH野生型，而NGS检出致病性变异。此外，3个样本被归为IDH突变型，但NGS未检出致病性变异（表1）。报告没有具体说明IHC检测使用的抗体类型，也没有说明是否为CEIVD抗体。而MLPA检测的4个样本中，1个样本检测结果与NGS不一致，MPLA显示IDH野生型，而NGS显示致病性变异。

表1. 外院（IHC）与我中心（NGS、qPCR、Sanger）IDH1检测结果

由于IDH1/2 NGS检测结果与IHC（7/13）和MLPA（1/4）不同，使用了两种独立的方法验证NGS检测结果：qPCR和Sanger测序。首先，使用了IDH1/2突变检测试剂盒（CE-IVD），该试剂盒可检测8个IDH1和9个IDH2变异。其次，Sanger测序使用的是同一组引物，但基因分析仪更新了。NGS、qPCR和Sanger测序的LOD分别为5%、1%和20%，将NGS检测结果同34个qPCR样本和31个Sanger测序样本检测结果进行了比较，显示100%的一致性、100%的特异性和100%的灵敏度。3个样本由于DNA严重降解，质量不佳，缺少扩增模板，无法进行Sanger测序来确定IDH1/2状态。不过这3个样本通过了qPCR的内部质控，qPCR检测结果与NGS一致。

此外，将4例患者MLPA报告结果同NGS、qPCR和Sanger测序结果进行了比较。由于MLPA检测的突变范围有限（R132C、R132H、R172K和R172M），不包括R132L突变，1例是假阴性结果。

MLPA检测试剂盒检测IDH1/2变异数量有限，导致与NGS的一致性为75%，灵敏度为66.6%，特异性为100%。然而，这些结果并不具有代表性，因为MLPA样本数量有限（只有4例患者；表2）。

表2. 外院（MLPA）与我中心（NGS、qPCR、Sanger）IDH1检测结果

IHC检测结果与NGS的一致性仅为38.5%，灵敏度为33.3%，特异性为42.9%。由于样本数量有限，且报告来自不同的地方，灵敏度和特异性不能充分反映IHC方法的可靠性（图6）。

图6. 外院IHC、MLPA与我中心NGS、qPCR、Sanger检测结果比较。IHC和MLPA有2例假阳性结果，IHC有1例假阴性结果。

基于WHO CNS5重新评估诊断

考虑到分子标志物的作用越来越大，以及WHO CNS5的诊断建议，可进行NGS和FISH检测，来重新评估诊断。

使用NGS，在所有（3/3）WHO 3级IDH野生型胶质瘤患者中检出了TERT启动子致病性变异。新的WHO CNS5分类建议将这些患者归为4级胶质瘤，而不是3级（见表3）。对携带IDH1/2致病性变异的2级（A2）或3级星形细胞瘤（A3）患者的样本进行了CDKN2A检测。

表3. 基于NGS检测结果和WHO CNS5 2021新分类的诊断变化

由于2个检测样本均未显示纯合缺失，因此这2个胶质瘤患者无需调整分类（图7）。从WHO 2级到4级的变化对治疗和随访方案非常重要。然而，本研究没有携带TERT启动子突变的IDH野生型2级胶质瘤患者。

图7. FISH和NGS CNV检测胶质瘤CDKN2A纯合缺失

讨 论

NGS相比IHC或MLPA的优势

IDH1/2状态可以通过多种方法检测。十年前，我们团队使用各种技术，包括IHC和分子基因检测（PCR，Sanger），研究了IDH1/2的预后价值。这些年来，大多数实验室已将IHC、焦磷酸测序、qPCR或MLPA作为胶质瘤常规诊断方法。在本研究中，我们使用NGS检测了所有已知和新的变异，并同IHC、Taqman特异性探针（qPCR）、杂交（MLPA）和Sanger测序进行了比较。在评估来自外院的IDH（IHC或MLPA）报告时，我们发现了临床上显著的不一致，对WHO分类和治疗有影响。进行了NGS检测，发现IHC和MLPA结果分别有7/13和1/4与NGS不同。为了更好地了解这些差异对临床决策的影响，进行了qPCR和Sanger测序，结果证实了所有基于NGS的诊断。

值得注意的是，非典型IDH突变在幕下星形细胞瘤中发生率为80%，在幕上星形细胞瘤中为10%。对此，可使用IHC、MLPA或qPCR进行筛查，阴性结果需要重新进行NGS检测。本研究中，有一名患者携带非典型突变，所以IHC没有检出。

研究发现，13个外院IHC检测结果中，有7个IDH1/2状态错误分类。虽然立体定向活检经常用于脑肿瘤诊断，但只能获取少量组织。这可能会影响IHC检测，导致假阴性结果。此外，组织（手术或立体定向活检）检测前的标准化处理，组织病理学染色和IHC在医院极难实施。因此，IHC检测中的人为因素及组织固定包埋的挑战降低了IHC检测的灵敏度，增加了数据分析的难度。相比之下，在NGS、Sanger测序和qPCR中，DNA被扩增，从而样本肿瘤组织较少也能检出变异。这解释了为什么检测结果不一致。3个样本IHC显示IDH野生型，而NGS和qPCR检测到IDH1/2基因突变。

考虑到目前的2021 WHO分类建议检测多个基因变异，临床应用应基于高通量技术检测，例如胶质瘤中使用NGS，而不是耗时的级联诊断。此外，IHC、Sanger测序、PCR或FISH（用于检测IDH1/2、TERT、EGFR、CDKN2A和1p19q多种体细胞变异）等不同常规技术检测的总成本可能比单个NGS检测成本更高。

成人型星形细胞瘤患者的综合跨学科诊断规范

多年来，分子技术有了显著的发展。因此，纳入了分子指标用于更精确的胶质瘤分级和预后评估。2016年，WHO CNS分类首次使用分子标志物对胶质瘤进行分类，2021年，更加重视生物标志物。由于WHO CNS5是近期发表的，目前还没有文献描述星形细胞瘤的分子诊断标准。为了满足这一需求，我们提出了以下基于NGS检测结果的诊断规范（图8）。

图8. 星形细胞瘤患者综合跨学科诊断规范

诊断脑肿瘤的第一步是在手术过程中获得可靠的组织。当显微手术切除不可行时，应进行立体定向活检，因为它安全、有效，并且获取的诊断组织与开放手术样本高度一致。根据CNS5 2021分类，获取具有代表性的样本用于组织学和分子检测非常重要。其次，IDH基因状态检测似乎是星形细胞瘤患者治疗的关键步骤。基于IDH1/2基因检测和组织病理学检测结果，应确定进一步分子诊断的方向。诊断星形细胞瘤患者时，应首先进行组织病理学分级评估，尤其是将4级胶质瘤（存在坏死和微血管增生）与2级或3级胶质瘤区分开来。对于2级和3级星形细胞瘤，我们建议将NGS作为首选方法。检测应覆盖尽可能多的胶质瘤生物标志物。NGS panel必须覆盖IDH1/2、TERT，可以额外检测PIK3CA和TP53，但不是必须。我们还建议通过NGS检测CDKN2A、EGFR和+7/-10染色体CNV。如果NGS panel不包括CNV，则必须通过FISH对IDH突变型星形细胞瘤进行检测，以确定是否存在CDKN2A纯合缺失或EGFR扩增。

另一方面，在IDH野生型星形细胞瘤中，进一步的治疗取决于TERT启动子致病性变异和EGFR扩增。因此，通过NGS同时检测IDH1/2、TERT启动子和EGFR扩增，能够快速准确地对患者进行2021 CNS5分类。如果先前被归为IDH野生型星形细胞瘤患者检出TERT或EGFR变异，则应诊断为IDH野生型胶质母细胞瘤。如果没有检出TERT启动子致病性变异和EGFR扩增，则需要检测是否存在+7/−10染色体变异。既可以用涵盖CNV的NGS检测，也可以单独进行FISH检测。如果检出+7/−10染色体变异，则诊断为IDH野生型胶质母细胞瘤；如果未检出，则诊断为IDH野生型星形细胞瘤。对于4级星形细胞瘤，仅确定是否存在IDH基因突变就足够了。如果检出突变，WHO CNS5建议将其归为IDH突变型4级星形细胞瘤；如果没有检出突变，需要诊断是否为IDH野生型胶质母细胞瘤。

可以额外检测预后和预测生物标志物，例如MGMT甲基化，特别是在IDH野生型和A4 IDH突变型胶质母细胞瘤中。最后，将组织病理学和分子检测结果结合起来，可以做出可靠而准确的诊断，从而实现精准治疗。

虽然WHO CNS5仅建议4级胶质瘤患者检测IDH基因，但我们建议进行NGS检测，使用覆盖星形细胞瘤中最重要和突变频率最高的基因（如IDH1/2、TERT、EGFR、TP53和PIK3CA）panel。这样诊断不仅可以基于组织学特征（坏死和血管浸润），还可以基于分子变异（WHO CNS5纳入的与生存期较短相关的变异）。因此，使用NGS检测多个基因可以使预后评估更加准确。

根据在WHO CNS5之前发布的欧洲神经肿瘤学协会（EANO）指南，如果IHC检测结果为IDH野生型，则需要进行IDH分子检测。值得注意的是，这些IHC指南是在WHO CNS5纳入完整的新型分子生物标志物列表之前制定的。因此，应修改这些建议，纳入NGS，可以一次性检测多个指标。因此，如果需要检测多个生物标志物，来对胶质瘤准确分类，应一开始就进行全面检测，尤其是当样本量有限时。

总之，推荐NGS检测。第一，检测IDH状态，本研究表明，该方法结果更可靠；第二，可以检测多个生物标志物。FISH通常用于检测CDKN2A纯合缺失，+7/−10或EGFR扩增，预计将在不久的将来会被NGS CNV取代。

局限性

本研究有几个局限性。没有关于每名患者IDH1/2检测方法的信息，因为是在12个不同的地方进行的检测。由于组织病理学检查报告没有说明IHC抗体的类型，无法确定哪种特定抗体导致假阳性和假阴性结果。此外，仅对34个胶质瘤样本进行了NGS检测，因为只有这些样本符合质量标准。使用的是成人胶质瘤16基因NGS panel ，和84基因NGS CNV panel。没有关注FGFR、NTRK基因家族、NF1或H3 H3F3A，这些也是必要的关注点，特别是对于儿童胶质瘤分类。

可依据组织病理学结合分子检测结果进行精确的诊断，从而实现精准治疗。本研究表明，NGS作为一种新的方法可以完善胶质瘤分子检测结果，提高分类准确性，尤其是星形细胞瘤。WHO CNS5指南表明了结合组织病理学和分子检测结果对恶性胶质瘤进行分类的重要性，应将肿瘤组织学亚型和分级与各种分子生物标志物结合起来，如基因突变和CNVs。此外，本研究提出了一种基于WHO CNS5的胶质瘤患者NGS分子检测新规范。

参考文献：

Śledzińska P, Bebyn M, Szczerba E, Furtak J, Harat M, Olszewska N, Kamińska K, Kowalewski J, Lewandowska MA. Glioma 2021 WHO Classification: The Superiority of NGS Over IHC in Routine Diagnostics. Mol Diagn Ther. 2022 Sep 2. doi: 10.1007/s40291-022-00612-3. Epub ahead of print. PMID: 36053463.