基因組學研究發現了能夠導致腫瘤發生和進展的基因突變。
部分致癌突變會產生具有新活性的蛋白，能夠與其他蛋白產生新的相互作用，從而發揮原蛋白所不具有的功能。
如果能高通量地鑑定這種突變體產生的新蛋白間相互作用（neoPPIs），必然將為精準靶向藥物開發帶來極大便利。
5月4日，來自埃默里大學醫學院的傅海安教授團隊在《細胞》雜誌發表重要研究成果[1]。 他們 開發了一個高通量篩選平台——qHT-dS，能夠鑑定突變體蛋白介導的neoPPIs。基於qHT-dS，研究人員發現 高頻致癌突變BRAFV600E 能夠與KEAP1產生neoPPI，激活NRF2介導的氧化還原途徑。
雖然之前有研究表明，KEAP1-NRF2通路能夠清除細胞內的活性氧，幫助腫瘤細胞應對氧化應激，從而促進腫瘤細胞的生存和耐藥[2]；但是物極必反，研究人員發現這一通路的激活暴露了腫瘤細胞的一個弱點，即 對由NRF2調控的抗氧化因子——NAD(P)H:醌氧化還原酶1（NQO1）的特異性毒性底物格外敏感，從而提供了治療靶點。
這項研究證明了腫瘤基因改變能夠產生新的蛋白間相互作用，為突變體指導的精準醫學治療提供了新策略。
論文首頁截圖
基因的錯義突變會產生新表位，可能改變編碼蛋白的內在特性，誘導新的互作或減弱原有的互作。這種 新表位誘發的差異蛋白互作（Df-PPIs）可能會重塑致癌通路，從而影響腫瘤的生物學行為。
即便是同一基因，不同的突變位點對腫瘤生物學行為的影響也不同[2]。在胺基酸水平研究突變體的臨床意義，既是挑戰也是精準醫療的需要。
此外，編碼轉接體蛋白和抑癌蛋白的基因突變是難以直接靶向的，這些蛋白主要通過與其他蛋白互作發揮功能[3]，因此 了解突變體如何改變蛋白互作網絡，將為治療提供下游靶點。
基因突變可能會改寫下游信號通路
目前突變誘發neoPPIs的頻率和圖譜還沒有建立，主要的障礙是如何在活細胞中系統性地研究這些相互作用。為了解決這一問題，研究者們建立了一種基於生物發光共振能量轉移（BRET n ）技術的平台qHT-dS，能夠在活細胞中高通量、定量地篩選產生neoPPIs的基因突變位點。
為了針對性地研究致癌基因突變編碼蛋白和癌症相關蛋白的相互作用，研究人員先是篩選了18個致癌突變位點（包括2個致癌基因和4個抑癌基因）和556個野生型癌症相關基因，構建了過表達文庫。
之後，研究人員在1536孔板上建立了基於BRETn 的超高通量PPI篩選體系：在HEK293T細胞中轉染帶有Nanoluc螢光素標籤的野生型（WT）或突變型（MUT）致癌基因表達質粒，作為BRETn 的供者；轉染帶有Venus螢光蛋白標籤的癌症相關基因表達質粒，作為BRETn 的受者。要產生陽性的BRET n 信號，供者和受者間距離需要小於10nm，因此能夠準確反應蛋白之間的直接作用 。
qHT-dS平台技術路線圖
通過自動化的工作流程，研究者們系統地測試了18個突變體蛋白及其對應的6個野生型蛋白與556種癌症相關蛋白的兩兩相互作用，並通過自主開發的互作重塑比較分析算法（CARINA）鑑定出了8839個蛋白互作。
緊接著，研究人員用較為嚴格的標準篩選出高標準差異蛋白互作（HS-Df-PPIs），其中包括突變體相對於野生型增加的蛋白互作（HS-Go-PPIs）359個、減少的蛋白互作（HS-Lo-PPIs）13個。
如果從致癌基因角度分析這些HS-Df-PPIs，會發現同一基因的不同突變位點，甚至是同一突變位點的不同胺基酸殘基改變，所導致的PPI網絡變化都有很大差異。這一結果印證了在胺基酸殘基水平研究突變體意義的必要性。
此外，抑癌基因突變既有HS-Lo-PPI又有HS-Go-PPI，說明 抑癌基因的突變不僅導致抑癌功能的失活，也會使其獲得新的活性。而致癌基因突變以Go-PPI為主，說明致癌基因突變可能重塑致癌通路或引起其他通路變化。
而從癌症相關蛋白的角度分析，可以發現 35%的HS-Go-PPI夥伴蛋白與致癌突變具有重現性的相互作用（與3個或3個以上突變位點都有互作），這些蛋白富集在生長調控相關的通路，如細胞周期、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT通路；而大部分（65%）的HS-Go-PPI夥伴蛋白只與1-2個突變位點有互作，說明這是突變導致的特異性改變。
左. 聚類分析揭示了重現性和突變特異性Df-PPI夥伴蛋白；右. 重現性Df-PPI夥伴蛋白通路富集分析
儘管qHT-dS平台有高通量和定量化的優點，但因為利用了螢光標籤和蛋白質過表達系統，對化學測量有一定影響，得到的結果可能不符合腫瘤細胞的實際情況。因此，有必要通過不使用螢光標籤的蛋白互作試驗對得到的HS-Df-PPIs進行驗證。
研究者們通過GST pull-down、NanoPCA、semi-IP、co-IP等一系列互補的試驗進行驗證。以BRAF V600E 突變為例，有六個HS-Go-PPIs得到四個試驗同時支持，夥伴蛋白分別是BCL2L1、GSK3A、KEAP1、PDCD2L、POLE和VHL。這些蛋白互作成為候選neoPPIs，值得進一步進行功能實驗。
對BRAF V600E 突變HS-Df-PPIs的蛋白互作正交實驗驗證結果
研究人員以BRAF V600E /KEAP1這對蛋白互作為例進行了功能研究，結果發現 BRAF V600E 通過增加與KEAP1的親和力，與NRF2競爭結合KEAP1，從而釋放NRF2的活性，並增加其下游NQO1的蛋白表達和活性 。
NQO1是一種控制醌代謝的還原酶，能夠解毒外源性醌化合物，清除細胞內的超氧化物，具有廣泛的細胞保護作用[4]。NQO1在腫瘤細胞中常常過表達，並且與腫瘤轉移和不良預後相關[5]。
研究者們檢驗了一種NQO1特異性的毒性底物DNQ對細胞生存的影響，結果發現 攜帶BRAF V600E 突變的細胞生長抑制比WT更明顯 。而在DNQ處理細胞後，再加用BRAF抑制劑vemurafenib，兩藥展現出明顯的協同作用。
因此，BRAF V600E 與KEAP1的neoPPI激活了NRF2介導的氧化還原途徑，上調了NQO1表達，從而讓腫瘤細胞對NQO1毒性底物更加敏感。 新發現的NQO1毒性底物與vemurafenib的聯合治療策略值得進一步探索。
BRAF V600E /KEAP1 neoPPI重塑氧化還原途徑的機制以及暴露的治療靶點
總的來說，本研究開發了高通量、定量鑑定neoPPIs的技術平台，精準繪製了致癌突變位點導致的Df-PPIs圖譜，揭示了基因突變引起neoPPIs的普遍性，以及同一基因不同突變位點所產生的neoPPIs的差異。
對BRAF V600E /KEAP1 neoPPI的功能研究發現了氧化還原通路的潛在治療靶點NQO1。其他候選neoPPI值得未來進一步探索，將為開發突變位點導向的精準治療策略提供極大幫助。
參考文獻：