為了理解發育和疾病發生機制，研究人員需要揭示複雜的多細胞組織的結構。組織學和免疫螢光技術可顯示組織形態學和生物標誌物。空間 RNA 測序(RNA-seq)利用新一代測序(NGS) 的力量，以空間解析度分析基因表達 1 。
空間轉錄組學實驗將分子和形態學特徵相結合，可以提供以前無法獲得的組織生物學信息。組織範圍內的全轉錄組分析可以實現真正的探索性科學研究，並有助於揭示健康和疾病狀態下細胞之間的空間關係 2-7 。
今天，為大家介紹的是一種從組織切片繪製完整轉錄組，同時保留形態學背景的方案：
- 使用10x Genomics的Visium空間基因表達，對整個組織切片進行轉錄分析。
- 使用NovaSeq 6000、NextSeq 2000、NextSeq 1000 或 NextSeq 550系統對空間RNA-Seq文庫進行測序。
- 可視化覆蓋基因活性的組織形態，以了解正常組織和病變組織細胞之間的空間關係。
實驗方案概述
典型的空間RNA-Seq實驗遵循一個由組織樣本製備、成像、 文庫製備、測序和分析組成的工作流程（圖1）。本實驗方案使用10x Genomics的Visium空間基因表達和成熟的Illumina測序技術。從新鮮冷凍或福馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織開始，製成切片並置於Visium玻片上。對組織切片進行染色，使用 Visium試劑生成添加條形碼、空間感知的全轉錄組文庫。在Illumina生產規模的測序系統上對文庫進行測序， 如 NovaSeq 6000、NextSeq 2000、NextSeq 100或NextSeq 550系統。使用 Space Ranger 流程(10x Genomics)進行數據分析，藉助來自 Visium 玻片的空間條形碼，將轉錄組基因表達結果與組織位置相關聯。Loupe Browser軟體(10x Genomics) 可以輕鬆地在組織圖像的形態學數據之上可視化和探索空間基因表達數據。
圖1：空間 RNA-Seq 實驗的工作流程
1）製備組織切片
根據您的樣本類型(新鮮冷凍或 FFPE)選擇合適的 Visium 空間基因表達實驗方案。可在10x Genomics 支持中心網站上獲得Visium 樣本製備的演示方案 8-9 。
2）對組織切片進行染色和成像
使用標準技術對放置在 Visium 玻片上的組織切片進行蘇木精-伊紅(H&E)或免疫螢光染色。使用顯微鏡對染色組織切片進行成像。成功的基因表達可視化高度依賴於良好的染色和成像實踐 10 。
3）透化組織並構建文庫
對組織切片成像後，可使用Visium空間基因表達試劑盒捕獲新鮮冷凍或 FFPE組織的轉錄本。Visium 空間基因表達玻片有四個正方形區域或捕獲區域，每個玻片最多可運行四個組織切片*。每個捕獲區域有數千個條形碼位點，包含數百萬個捕獲寡核苷酸，每個位點都有唯一的空間條形碼(圖2)。
* 在文庫製備期間，每個捕獲區域還會獲得一個樣本條形碼，以便在一次測序運行中，可以混合來自不同捕獲區域的多個文庫。其他Visium玻片的每張玻片有兩個或八個捕獲區域。
圖2：Visium 空間基因表達玻片設計
4）使用Illumina儀器測序
依照空間組學的測序需求，建議在 NovaSeq 6000、NextSeq 2000、NextSeq 1000或NextSeq 550系統上對Visium空間基因表達文庫進行測序(表1)。小規模儀器，如iSeq 100系統可用於文庫質量控制 11 。
表1：Illumina 測序系統上 Visium 空間基因表達分析的樣本通量示例
Visium空間基因表達文庫包含標準的Illumina雙端構建體， 兩側為i5和i7標籤，這些標籤是Illumina 流動槽結合所必需的(表2，圖3)。Read 1引物用於測序16 bp的空間條形碼和長達12 bp的唯一分子標記(UMI)。Read 2引物用於測序cDNA，或連接探針、插入片段。兩個10 bp樣本標籤在i5和i7 read中進行測序 12 。
Visium文庫的建議測序深度取決於幾個因素，包括組織複雜性、組織覆蓋度和實驗目的。空間基因表達文庫需要通過雙端測序運行進行測序。 （更多詳細信息，請下載全文）
表2：Visium空間基因表達文庫的建議read 配置
圖3：Visium 空間基因表達文庫配置— Visium空間基因表達文庫包括與 Illumina 測序系統兼容的標準雙端構建體。
5）數據的分析和可視化
在 Visium工作流程中，捕獲兩種主要數據類型:組織圖像和BCL或FASTQ格式的測序數據。Space Ranger分析流程使用這兩種數據輸入將Visium測序數據與圖像比對。根據相關的空間條形碼，將捕獲的檢測到的每個基因轉錄本分配至組織圖像上的空間位置。數據處理後，您可以使用Loupe Browser可視化軟體輕鬆查詢空間基因表達數據的不同視圖。Loupe Browser允許您研究重要的基因、表征和分析簇，並進行差異表達分析。或者，您可以使用第三方工具進一步處理數據。
數據亮點
空間轉錄組學分析能夠在新鮮冷凍組織(圖4) 13 或 FFPE樣本 (圖5)的組織環境中對基因表達進行高解析度表征 14 。
圖4:新鮮冷凍小鼠大腦數據亮點—(A)小鼠大腦冠狀切片的 H&E 染色圖像。(B)覆蓋全部UMI的Visium 數據，用於基於總差異表達基因的全轉錄 組分析或空間天然位點聚類分析。(C)簇 4 中表達水平最高的基因列表 13 。
圖 5:乳腺導管原位癌的 FFPE 乳腺組織數據亮點 — 使用適用 FFPE 的 Visium 空間基因表達，對乳腺導管原位癌 FFPE 樣本中約 1.8 萬個基因進行了檢測。(A)H&E 染色圖像與 Visium 的數據疊加，用於 FFPE 全轉錄組分析，此處顯示為(B)基因總數和(C)位點聚類分析。(D)關鍵乳腺癌基因的表達水 平和空間結構如下所示:ERBB2(HER2)、孕酮受體(PGR) 和雌激素受體(ESR1) 14 。
專家支持
10x Genomics 和 Illumina 團隊合作，確保您在對 Visium 空間基因表達文庫進行測序時，在整個工作流程中得到充分支持。如有檢測和分析相關問題，請聯繫10x Genomics 支持中心 ([email protected])，如有測序相關問題，請聯繫 Illumina 支持中心 ([email protected])。這些團隊還可以合作處理更複雜的問題。
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NovaSeq 6000系統
NextSeq 1000和NextSeq 2000系統
NextSeq 550系統
Visium空間基因表達
參考文獻