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大家有過這樣的疑惑嗎？
為啥 BRCA1 和 BRCA2 的種系突變大機率會導致乳腺癌或卵巢癌，而非其他組織癌變 ？同樣，為啥 BRAF突變通常引發的是皮膚癌黑色素瘤嘞？還有， APC突變是結腸癌的標誌， VHL 基因缺失是腎癌的特徵 ……
在這些大數據得出的結論背後，研究學者留意到，促癌突變似乎僅會在某些特定器官中導致癌變，即 癌症相關突變會表現出強烈的組織選擇性。
不過，與體細胞突變相比，腫瘤遺傳易感基因突變通常與組織特異性癌症風險的相關性更強。然而，這種基因突變如何導致組織特異性癌症表型，仍是癌症生物學中一個懸而未決的問題[1]。
近日，英國 劍橋大學的Sakari Vanharanta團隊在《自然》雜誌上發表了重磅研究成果。
他們通過分析人類腎癌細胞發現， 組織特異性癌症表型是譜系轉錄因子（TF）與基因突變「裡應外合」的結果，而且器官特異性轉錄因子是腫瘤遺傳易感基因突變引起組織特異性癌症的關鍵決定因素[2]。
也就是說， 基因突變影響到特異性調控組織細胞生長發育的信號通路時，才有可能引發該組織產生癌變。
例如，在人腎透明細胞癌（ccRCC）中， VHL 功能喪失會導致腎臟譜系轉錄因子PAX8調控的下游致癌信號放大 （細胞周期蛋白D1過量表達），加速腎癌細胞增殖。
簡單來說， VHL 突變恰好影響了特異性調控腎臟細胞生長發育的信號通路，所以才參與了腎透明細胞癌的發生和發展。換做其他的組織器官，細胞的生長發育信號通路不一樣， VHL 突變就不能發揮促癌作用了。
論文首頁
據報道，約90%的ccRCC存在 VHL 功能喪失性突變，但這一突變在其他癌症類型卻較為罕見[3]。
顯然，ccRCC這種特殊的基因特徵在研究組織特異性癌症表型的工作中具有得天獨厚的優勢。
之前的研究表明，定義正常細胞狀態的轉錄網絡可能對致癌過程至關重要[1]，而轉錄因子 （如黑色素瘤中的SOX10）通常是癌細胞生存和增殖所需要的[4]。於是，Vanharanta團隊借ccRCC的獨特性優勢，對組織特異性轉錄因子如何影響介導下游癌症相關基因改變的致癌表型展開了系統研究。
首先，研究人員以非ccRCC細胞系 （MDA-MB-231和HeLa）作為對照，對促進轉移性ccRCC細胞系 （OS-LM1和786-M1A）增殖的轉錄因子進行了合併功能缺失篩選。
結果顯示，PAX8和HNF1B對ccRCC細胞系表現出很強的特異性。 一旦抑制PAX8和HNF1B這兩種因子，染色質可及性則會顯著降低，特別是遠端調節元件。
ccRCC細胞系（a）和非ccRCC細胞系（b）的合併功能缺失篩選結果
ccRCC中VHL功能喪失性突變會導致缺氧誘導因子HIF1A和HIF2A的穩定，進而激活下游轉錄程序，其中HIF2A在ccRCC中起主導作用[5]。 因此，研究人員採用內源蛋白的快速免疫沉澱質譜分析（RIME），對HIF2A所占據的核復合物進行了表征。
結果表明，PAX8是HIF2A核相互作用組的成員之一。此外， 同時與HIF2A和PAX8組成復合體的蛋白共計99個，其中89個代表性核蛋白在染色質重塑 （SWI/SNF復合物）或mRNA加工等過程中發揮作用。
786-M1A細胞中與HIF2A和PAX8相互作用蛋白的RIME測定結果
隨後，研究人員對異種移植的ccRCC進行了染色質免疫共沉澱測序分析（ChIP-seq），他們發現， PAX8和HIF2A在染色質上共定位頻率相對較高，具體來說，786-M1A和OS-LM1細胞中，分別有43%和65%的HIF2A結合位點上結合了PAX8。
橋豆麻袋，這又是基因組學又是異種移植模型的，想說啥呢？
奇點糕這就為大家總結一下當前的研究結論：ccRCC特異性轉錄因子PAX8與致癌驅動因子HIF2A在染色質水平上存在相互作用，而且這些相互作用是由DNA和共享的染色質因子復合物介導的。
786-M1A和OS-LM1異種移植腫瘤中，PAX8峰（紅色）在所有高置信度染色質開放區域以及HIF2A ChIP-seq峰中的比例
我們接著講，在上述研究的基礎上，研究人員抓住問題中的「主要矛盾」，以HIF2A為突破口來探究PAX8與HIF2A相互作用對腎癌細胞的影響。
為了揪出介導HIF2A驅動ccRCC形成的基因調控元件，研究人員先創建了一個包含706對靶向HIF2A的單導RNA（sgRNA）文庫，再將該文庫中的sgRNA與dCas9-KRAB共轉導進786-M1A細胞中，然後將這些經過特殊改造的細胞接種到15隻NSG小鼠身上，待腫瘤形成後，收集腫瘤組織並測定各自的sgRNA水平。
Vanharanta團隊發現，共有21個靶向HIF2A結合增強子的sgRNA在腫瘤中耗盡，其中有16個同時與HIF2A和PAX8結合。 耗竭最嚴重的是靶向染色質 11:69,419,632-69,420,080（後文寫為 E11:69419） 的sgRNA，這個增強子與一個大型臨床ATAC-seq癌症數據集中最強的ccRCC特異性開放染色質區域之一重疊，並在ccRCC中被明顯激活，而在乳頭狀RCC中卻沒有。
對照組和敲除PAX8的細胞的中位ATAC-seq信號，以及異種移植腫瘤中HIF2A與PAX8的中位ChIP-seq信號（*表示E11:69419）
此外，研究發現 增強子E11:69419的兩側是 MYEOV 和 CCND1 基因 。據報道， CCND1 編碼的細胞周期蛋白 D1在多種癌症類型中被激活，包括ccRCC，而且其表達受VHL-HIF2A途徑調控[6-7]。
於是，研究人員採用短髮卡RNA（shRNA）敲除 MYEOV 和 CCND1 基因，結果不出所料，這兩種基因的敲除能夠顯著延緩腫瘤進展，而且敲除 CCND1 的效果更佳。
他們還發現，E11:69419或VHL抑制均會導致 MYEOV 和 CCND1 這兩種基因表達顯著下調。抑制PAX8和HIF2A同樣也能降低基因 CCND1 的表達水平，這說明 PAX8和HIF2A可能是調控 CCND1 表達的上游信號 。
抑制E11:69419、VHL或PAX8後，腎癌細胞中 CCND1 和 MYEOV 的表達水平
經過研究分析，Vanharanta團隊發現，E11:69419序列中顯示的兩個假定結合位點是PAX8和HIF2A，而非HNF1B。
這一結果 再次印證了PAX8與HIF2A相互作用的結論，並揭示了促成二者相互作用的介質—增強子E11:69419。
此外，他們還發現，敲除PAX8會降低HIF2A在E11:69419上的結合，而敲除HIF2A卻不影響E11:69419上PAX8的結合，說明 HIF2A在E11:69419上的結合是PAX8依賴性的。
對照組或敲除PAX8的786-M1A 細胞中， E11:69419 以及PAX8非依賴性區域 E14:34035 中HIF2A 抗體或 IgG 的免疫沉澱結果
同時，他們發現，PAX8通過招募HNF1B可以控制MYC表達，而MYC與腎癌向繼發部位的擴散相關，這表明PAX8在控制驅動癌症轉移方面也有關鍵作用。
研究至此，我們基本可以推斷： 腎系轉錄因子PAX8是導致VHL突變誘發腎癌而非其他癌症的關鍵因素。
在正常腎細胞中，VHL蛋白會降解HIF2A蛋白，增強子E11:69419上僅結合PAX8，調控細胞周期蛋白D1的表達，從而確保細胞正常增殖。
然而，腎癌細胞中，VHL功能喪失性突變導致HIF2A水平升高，其與PAX8均能結合在增強子E11:69419上，促進細胞周期蛋白D1的表達增加，從而加速腎癌細胞異常增殖。
遺傳突變與腎癌發展示意圖[10]
總的來說，這項研究對決定癌症風險的種系突變和體細胞突變與發育譜系因素之間相互作用的機制提供了深入見解，闡明了PAX8在調控腎癌致癌信號傳導中的關鍵作用，為創造靶向譜系轉錄因子、實現器官特異性靶向療法打開了新大門！
參考文獻：
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