環狀RNA（circRNA）是一種新興的內源性非編碼RNA（ncRNA），它們參與細胞增殖、粘附、凋亡和存活等多個生物學過程[1]。
近年來，circRNAs在腫瘤領域也獲得了越來越多的關注。有研究表明許多 circRNA能促進細胞周期發展，抑制或誘導腫瘤細胞凋亡以及抑制血管生成等等[2]，各種不同的circRNAs在腫瘤發生髮展過程中起著不同甚至相反的作用。
雖然越來越多的研究報道了乳腺癌、肺癌和結直腸癌中異常的circRNAs[3]，但circRNAs在腫瘤細胞中的生物學功能、分子機制和環狀模式尚不清楚。此外，還有研究提出circRNAs可以通過病理功能未知的外泌體分泌到循環中[4]，且比線性RNAs更容易被分選進入外泌體。然而，circRNAs的外泌體特異性分選機制也仍然完全未知。
近日，來自 浙江大學張紅河和中國藥科大學來茂德領銜的研究團隊， 闡明了circRHOBTB3在結直腸癌（CRC）進展中的生物學作用、環化過程和分泌途徑，這一結果發表在 Molecular Cancer 期刊上。
他們發現， 抑瘤circRHOBTB3通過外泌體被癌細胞排出，以維持結直腸癌細胞的活性。此外，他們還 設計了靶向circRHOBTB3的環狀化和分泌元件的反義寡核苷酸（ASOs），用於CRC的治療。
論文首頁截圖
circRHOBTB3是宿主基因RHOBTB3轉錄後剪接和環狀化而產生的一種circRNA。RHOBTB3作為Rho GTPase家族ATP酶，參與膜轉運[5、6]和蛋白酶體降解[7]。
先前的研究也表明circRHOBTB3在CRC、卵巢癌、胃癌和肝細胞癌（HCC）中作為腫瘤抑制circRNA。然而，它的循環模式和外泌體分泌途徑並未被闡釋。
首先，研究人員分析了來自GEO資料庫的12例CRC患者、21例HCC患者、32例胰腺腺癌（PAAD）患者和14例健康供體的血清外泌體的總RNA-seq數據。
結果顯示， 許多circRNAs在腫瘤患者血清外泌體中的表達程度不同（圖1A），但 在所有三種癌症來源的外泌體中，只有hsa_circ_0007444（circRHOBTB3）均表達上調（圖1B），且其宿主基因RHOBTB3在三種腫瘤組織中的表達與正常組織相比均無顯著性的增強（圖1C）。
圖1 不同類型癌症中ircRHOBTB3在患者血清外泌體中的表達情況
然而，對來自浙江大學醫學院邵逸夫醫院體檢的18例CRC患者和16例健康供者的血清樣本數據分析發現，與健康供者相比， circRHOBTB3在CRC組織中顯著下調，而宿主基因RHOBTB3顯著上調（圖2左二）。而且，在69個CRC組織樣本中檢測到的circRHOBTB3的表達結果顯示， circRHOBTB3水平較高患者的總生存期更好（圖2右一）。
圖2 ircRHOBTB3在CRC組織中患者血清外泌體中的表達情況
於是，研究者不禁假設，circRHOBTB3是否具有抑癌作用？
為了驗證這一點，他們先確定了 CRC患者血清外泌體中的circRHOBTB3確實來源於腫瘤細胞而非基質細胞（圖3A），且circRHOBTB3水平在來自NCM460細胞（正常的腸上皮細胞系）的外泌體中最低（圖3B）。進一步在RKO、HCT116細胞（CRC細胞系）中過表達或敲低circRHOBTB3，結果表明 circRHOBTB3可以抑制細胞遷移和侵襲能力（圖3C）。
圖3 circRHOBTB3來源與功能的體外驗證實驗
並且，他們通過對circRHOBTB3敲除/重新表達細胞系RNA-Seq數據的分析，以及RT-qPCR驗證發現， 在circRHOBTB3敲除的細胞系中代謝、增殖和上皮間充質轉化（EMT）通路相關基因顯著上調，而circRHOBTB3的重新表達降低了這些基因的表達。 此外，circRHOBTB3敲除的細胞系中ROS水平也顯著升高。
他們還發現circRHOBTB3的結合蛋白是ENO1和ENO2。也就是說，circRHOBTB3可能通過與ENO1和ENO2等代謝酶相互作用，調節細胞內ROS水平，抑制腫瘤細胞增殖和EMT。
為了驗證circRHOBTB3在體內的功能，研究人員將過表達circRHOBTB3的HCT116細胞（CRC細胞系）皮下注射到裸鼠體內，構建了異種移植瘤模型。研究發現，與不表達circRHOBTB3的對照（EV）組相比， circRHOBTB3過表達（circRHOBTB3-OE）組的腫瘤體積和重量都顯著更小，且細胞增殖能力也更弱（圖4A、B、C）。
而當他們在裸鼠脾臟接種實驗中觀察肝轉移表型時發現， circRHOBTB3-OE組肝轉移灶少於EV組（圖4D、E）。更為有趣的是，circRHOBTB3可以在異種移植瘤小鼠模型的血漿和尿液中檢測到，而在野生型小鼠的血漿和尿液中則沒有。此外， circRHOBTB3-OE組的血漿中circRHOBTB3的水平高於EV組（圖4F、G）。
圖4 circRHOBTB3功能的體內驗證實驗
根據這些數據，研究者們推測 CRC細胞必須通過外泌體分泌抑制腫瘤的circRHOBTB3來維持腫瘤侵襲和轉移的特徵，換言之，CRC細胞有特殊的「排毒」機制。
在隨後的研究中，研究人員發現了circRHOBTB3的環化機制，還發現circRHOBTB3本身的順式元件（141–240nt，141-165nt，216-240nt）可以調節circRHOBTB3通過外泌體的分泌過程（圖5）。
圖5 轉染了截斷的circRHOBTB3載體的細胞中circRHOBTB3外泌體分泌丰度
之前已經有研究發現，ESCRT-II亞復合物作為一種RNA結合復合物，可以將RNA分選至外泌體[8]中。在該文研究中，他們發現 SNF8可以結合到circRHOBTB3的141-240nt區域，促進circRHOBTB3被分選至外泌體並分泌到胞外。他們將這個過程被定義為「腫瘤外泌體逃逸機制」（圖6）。
圖6 SNF8敲低實驗以及外源的RIP實驗
受上述研究結果啟發，研究人員設計了二代ASOs，以增加circRHOBTB3的環化並減少分泌，這有望成為一種新的癌症治療策略。
研究人員設計了三種二代ASOs：一個靶向負環化的元件 （ASO-cir：266-290nt）和兩個外泌體分泌的元件 （ASO-exo1：141-165nt，ASO-exo2：216-240nt）（圖7）。
通過實驗他們發現，ASO-cir確實能增加circRHOBTB3的環化，但circRHOBTB3的分泌卻會同時增加；而ASO-exo1和ASO-exo2中，僅ASO-exo2 （以下簡稱ASO-exo）既增加circRHOBTB3的胞內水平，又阻斷circRHOBTB3外泌體的分泌。因此，研究者們考慮進一步使用ASO-cir和ASO-exo，研究二者聯合治療對結直腸癌的特異性和抗腫瘤效果。
圖7 二代ASOs及其作用機制
研究人員驗證了ASOs的聯合用藥的確比ASO-cir和ASO-exo的單獨用藥能產生更多的胞內circRHOBTB3，且小鼠實驗的結果符合預期：ASO-cir聯合ASO-exo確實顯著提高了脾臟原發病灶中circRHOBTB3的表達，還可顯著減少腫瘤惡病質，且能控制轉移（圖8）。
圖8 ASOs體外及體內實驗
總的來說，這項研究成果闡明了circRHOBTB3調節細胞間ROS和代謝途徑來抑制CRC的進展的機制，還且提出了一種新的腫瘤逃逸理論，即 腫瘤細胞通過「排泄」腫瘤抑制circRNA來維持癌細胞的活性（「腫瘤外泌體逃逸機制」）。
更重要的是，他們設計的二代ASOs可以通過靶向環化和分泌來調控腫瘤抑制circRNA，以此促進癌症的治療效果。且他們的臨床數據顯示，在CRC患者中，85.7%（30/35）的腫瘤樣本攜帶的circRHOBTB3水平低於配對的正常樣本，而腫瘤樣本中circRHOBTB3的低表達與較差的預後相關。這讓我們更加相信，這種ASOs將成為未來針對CRC的一種有前途的治療策略。
參考文獻
[1].Li X, Yang L, Chen LL. The Biogenesis, Functions, and Challenges of Circular RNAs. Mol Cell. 2018;71(3):428-442. doi:10.1016/j.molcel.2018.06.034
[3].Kristensen LS, Hansen TB, Venø MT, Kjems J. Circular RNAs in cancer: opportunities and challenges in the field. Oncogene. 2018;37(5):555-565. doi:10.1038/onc.2017.361
[5].Espinosa EJ, Calero M, Sridevi K, Pfeffer SR. RhoBTB3: a Rho GTPase-family ATPase required for endosome to Golgi transport. Cell. 2009;137(5):938-948. doi:10.1016/j.cell.2009.03.043
[7].Anne Matthys, Kathleen Van Craenenbroeck, Béatrice Lintermans, Guy Haegeman, Peter Vanhoenacker, RhoBTB3 interacts with the 5-HT7a receptor and inhibits its proteasomal degradation.Cellular Signalling.2012;24(5):1053-1063. Published 2012 May. doi：10.1016/j.cellsig.2011.12.027
[8].van Niel G, D'Angelo G, Raposo G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018;19(4):213-228. doi:10.1038/nrm.2017.125