結直腸癌（CRC）是全球最常見的癌症之一，大量證據表明，飲食、吸煙、肥胖和運動等生活習慣均與CRC的發病密切相關。
吸煙不僅會提高肺癌發病風險，也會促使結腸、腎臟和胰腺等器官發生癌變。研究表明， 吸煙會顯著增加人類結直腸癌的發病率和死亡率，在動物模型中也觀察到吸煙會增加結直腸癌發病的風險。
那麼一個非常直接的問題，吸煙究竟是如何促進CRC發生和發展的呢？這個目前尚不明了。
近日，由 香港中文大學於君領銜的研究團隊，在 Gut 上發表重要研究成果[1]。
她們發現 吸煙導致腸道菌群及其代謝物的組成發生改變，導致腸道屏障功能障礙和致瘤、促炎信號通路的激活，從而促進結直腸腫瘤的發生。
她們的研究提示，控制腸菌可能是一種預防吸煙人群患結直腸癌的潛在策略。
論文首頁截圖
吸煙與CRC的發病率和死亡率密切相關，探索其中的發生機制十分必要。
一方面，研究表明，吸煙會增加人腸道中細菌的多樣性[2, 3]，改變腸道菌群和粘蛋白結構[4]；另一方面，現有研究已證實了腸道菌群的改變與結直腸癌的發生存在相關性[5]，CRC患者來源的腸道菌群會促進受體小鼠發生結腸癌。
但是腸道菌群的改變是否代表著吸煙與結直腸癌的聯繫，目前並不清楚。
為了理清這一關係，於君教授團隊將偶氮甲烷（AOM）處理的C57BL/6小鼠每天分別在清潔空氣或香煙煙霧中暴露2小時，28周後，利用鳥槍法宏基因組測序和液相色譜-質譜法分析小鼠糞便中微生物和代謝產物的變化。
實驗造模流程圖
我們知道腹腔注射AOM會誘導小鼠發生CRC，那麼暴露在兩種不同空氣環境下小鼠的CRC發生情況是否會有不同？
研究結果顯示，與對照組的小鼠相比， 暴露在香煙煙霧中小鼠的結直腸腫瘤數目和大小顯著提高；而且免疫組化和蛋白質印跡均顯示腸道上皮中Ki67+細胞比例明顯增加，這意味著 香煙煙霧的暴露促進了小鼠結腸上皮細胞的增殖。
香煙煙霧促進了小鼠結腸癌的發生
接著，研究人員利用鳥槍法宏基因組測序對兩組小鼠的糞便微生物組進行分析， 她們發現，經過為期28周的處理後， 香煙暴露組小鼠腸道菌群的alpha多樣性明顯降低，beta多樣性聚類存在顯著差異。
香煙煙霧調節小鼠腸道菌群
相對對照組小鼠來說，暴露在香煙煙霧的小鼠中有20種細菌發生了明顯改變（p<0.05, FC>1.5），其中 Eggerthella. lenta 和 Staphylococcus capitis 顯著富集，腸道益生菌 Lactobacillus reuteri， Parabacteroides distasonis 和 Bacteroides dorei 減少。此外， 她們還發現兩組小鼠腸道菌群的關聯性發生顯著變化，在 香煙煙霧暴露組的小鼠中， E. lenta 與幾種益生菌的丰度呈現負相關，即伴隨著 E. lenta 的富集，幾種益生菌的丰度明顯降低 。
除了測序，研究人員還通過液相色譜-質譜法分析了小鼠的糞便代謝物，結果發現兩組小鼠的糞便代謝物具有顯著差異，有41種代謝物發生了改變（p<0.05），主要富集在膽汁酸代謝通路中，其中 牛磺脫氧膽酸（TDCA）的含量在香煙暴露小鼠中明顯增高，TDCA是次級膽汁酸中公認的致癌物。
那麼在香煙暴露組中，發生改變的腸道菌群跟糞便代謝物之間存在哪些關聯呢？通過相關性分析，研究人員發現 E. lenta 與TDCA呈現最強的正相關，而兩種減少的益生菌 Lactobacillus jensenii ， Lactobacillus crispatus 與TDCA則呈現負相關。因此， 失調的腸道菌群及其代謝物很可能是小鼠發生CRC的重要推手。
腸道細菌與差異代謝物的部分Spearman相關性分析
接著研究團隊研究了香煙煙霧對小鼠腸道屏障功能的影響， 她們檢測了結腸緊密連接蛋白的表達水平，發現香煙煙霧明顯降低了claudin-3和閉鎖小帶-1（ZO-1）的表達水平；另外，血清中脂多糖（LPS）水平顯著提高。這些結果表明 香煙煙霧會導致腸道屏障功能受損。
香煙煙霧降低了claudin-3和ZO-1的表達
為了從分子角度了解吸煙對原癌形成的影響，於君研究團隊對小鼠腸道上皮細胞進行基因檢測，與未吸煙組相比， 香煙暴露組的小鼠腸道上皮細胞有19個基因上調，7個基因下調。富集結果顯示，變化基因主要富集在絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號通路。
既往文獻報道TDCA可以激活MAPK通路的ERK亞家族，所以研究團隊評估了兩組小鼠腸道上皮中MAPK/ERK通路的激活情況。ERK1/2是MAPK/ERK通路中關鍵的調節蛋白，研究人員發現香煙煙霧能夠提高ERK1/2的磷酸化水平，且磷酸化的ERK1/2與TDCA呈正相關。以上結果提示 香煙煙霧會誘導ERK1/2發生磷酸化，激活MAPK/ERK通路，從而促使結腸癌的發生。
隨後，為明確炎症相關基因表達的變化，於君團隊檢測了兩組小鼠腸道上皮細胞的炎症和自免相關基因表達情況。結果發現，兩組的差異基因主要富集在白介素17（IL-17）和腫瘤壞死因子（TNF）信號通路。qPCR結果驗證了 香煙暴露組中促炎因子Il17a和Cxcl2轉錄水平的增加以及抑炎因子Il10的降低。這提示了 香煙煙霧促進了結腸中炎症的發生。
小鼠腸道上皮細胞的兩種晶片檢測基因表達結果
為了證實香煙煙霧引起的腸道菌群改變對結直腸腫瘤發生的直接作用， 她們對無菌小鼠進行了糞便菌群移植，將未吸煙組（GF-AOM）和香煙暴露組（GF-AOMS）小鼠的糞便分別移植到小鼠結腸部位。
與之前結果類似，GF-AOMS腸道菌群的alpha多樣性明顯降低，beta多樣性分析顯示與GF-AOM小鼠有顯著分離； E. lenta 仍然是在GF-AOMS中丰度最高的細菌，TDCA含量也顯著增高。此外在GF-AOMS中， 香煙煙霧組來源的微生物群同樣增加了結腸細胞增殖，損害了腸道屏障功能，增強了致癌信號通路MAPK/ERK和促炎基因的表達。因此，腸道菌群的改變有助於香煙煙霧在結直腸癌發生中的促腫瘤作用。
機制示意圖
總的來說，此研究發現吸煙可通過調節腸道菌群組成，誘導腸道菌群失調，促進結腸腫瘤的發生；代謝方面吸煙明顯促進TDCA的生物合成，其與腸道中E. lenta細菌呈顯著正相關；吸煙會損害腸道屏障，激活致瘤性MAPK/ERK信號通路。
本研究 首次建立了一種新型的腸道微生物介導的香煙煙霧致結直腸腫瘤發生機制，這提示我們，戒煙至少是通過重建健康的腸道微生物群來預防結直腸癌的可行方法之一。
參考文獻：
[2]. Biedermann L, Zeitz J, Mwinyi J, et al. Smoking cessation induces profound changes in the composition of the intestinal microbiota in humans. PLoS One. 2013;8(3):e59260. doi:10.1371/journal.pone.0059260
[3]. Biedermann L, Brülisauer K, Zeitz J, et al. Smoking cessation alters intestinal microbiota: insights from quantitative investigations on human fecal samples using FISH. Inflamm Bowel Dis. 2014;20(9):1496-1501. doi:10.1097/MIB.0000000000000129
[4]. Allais L, Kerckhof FM, Verschuere S, et al. Chronic cigarette smoke exposure induces microbial and inflammatory shifts and mucin changes in the murine gut. Environ Microbiol. 2016;18(5):1352-1363. doi:10.1111/1462-2920.12934