动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是最常见的心血管系统疾病之一，其形成受多种因素影响，其中衰老导致的多种功能障碍是重要的内在发病原因。随着人们生活水平的提高和生活习惯的改变，富含饱和脂肪酸的动物肝脏和多种高油脂食物进入人们的日常餐桌，这大大增加了低密度脂蛋白在血液中堆积的概率，加之血管韧性随年龄的增加而普遍降低，使得动脉粥样硬化成为我国老年人口的主要死亡原因之一。
目前越来越多的研究显示AS的实质为血管受损后的一种慢性炎症反应，其诱导的多种细胞因子、炎症介质以及炎症细胞又进一步恶化了AS的症状，成为恶性循环。比如血管内膜病变处招募单核细胞，单核细胞随后进入内膜活化并分化形成巨噬细胞，在吞噬大量脂质后形成泡沫细胞（泡沫细胞是一种含有大量脂肪的巨噬细胞，是导致动脉硬化的原因之一，并可能导致心脏病和脑梗塞），成为血管硬化的基础（Immunity, 2017）。为了攻克AS，研究人员对其发病机制已经进行深入研究，但其免疫机制在很大程度上仍未阐明。此外，该领域的大多数研究都依赖于动物模型，这些模型不能充分地再现人体的免疫环境，且缺乏自发的斑块破裂（Thrombosis and Haemostasis, 2016）。
文章简介
2019年10月7日，美国Icahn医学院的Chiara Giannarelli团队在《Nature Medicine》上刊登了题为：“Single-cell immune landscape of human atherosclerotic plaques”的文章，构建了人类动脉粥样硬化的第一个单细胞免疫图谱。该研究主要发现AS患者的斑块中存在CD4+ T细胞的独特亚群以及被激活和分化的T细胞群，且与斑块易损性相关亚群的巨噬细胞表现出选择性激活的表型。另外，硬化斑块会高表达PD-1（程序性细胞死亡蛋白1）而使T细胞发生耗竭后的重编程。最后，作者提出对于患有潜在心血管疾病的癌症患者，PD-1抑制剂的使用可能增加心血管疾病风险。
研究思路
为了建立动脉粥样硬化病变的免疫微环境图谱，识别其血液中的组分变化并探究临床心血管事件（clinical cardiovascular, CV）相关的细胞异质性的变化，作者结合CyTOF质谱流式细胞技术（mass cytometry）、单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）和可将蛋白质组和转录组数据整合的CITE-seq（cellular indexing of transcriptomes and epitopes bysequencing）技术对46名接受颈动脉内膜切除术的SYM（symptomatic：在6个月内收集到的斑块的同侧发生了脑缺血事件，即近期发病, 17例）和ASYM（asymptomatic：患者术前6个月内无缺血性事件发生，即近期未发病，29例）患者（平均年龄72.9 ± 8.7岁）的血液和斑块样本进行研究。
首先作者对15例患者（SYM 7例，ASYM 8例）进行CyTOF分析，发现与血液相比，斑块中的T细胞显示出明显的异质性。同时，还发现SYM斑块内T细胞适应性免疫失调。因此，作者对剩余31名患者进行了更深入分析，首先对患者斑块和血液中的T细胞进行了CyTOF分析，之后结合CITE-seq、scRNA-seq和细胞间相互作用分析研究了SYM和ASYM受试者的T细胞和巨噬细胞，鉴定了与CV事件相关的斑块特异性免疫变化（图）。
研究流程
研究结果
1 动脉粥样硬化患者斑块和血液的免疫表型分析
首先，为了研究免疫细胞在血液和硬化斑块之间的差异，作者通过跨组织和患者的共有蛋白进行无偏聚类分析，发现相对于血液，硬化斑块中CD4+和CD8+ T细胞的数量更多（～65％）。斑块中特别富集的免疫细胞包括：巨噬细胞、CD8+效应记忆（EM）T细胞、CD4+ EM T细胞和CD4– CD8– T细胞，而血液中为：CD14+单核细胞、自然杀伤（NK）细胞、浆细胞样树突状细胞（pDC）、B细胞和CD4+CD8+ T细胞（图3）。
图3 硬化斑块和血液中免疫细胞分布比例
2 CyTOF分析揭示了动脉粥样硬化患者T细胞亚群的多样性
为了进一步研究T细胞在血液和硬化斑块之间的差异，作者对ASYM和SYM患者进行CyTOF分析，发现CD8+T细胞在斑块中比血液中占优势，并发现存在多种高度异质的T细胞亚群（图4 a-d）。
图4 血液和斑块组织CyTOF分析中CD3+T细胞分布和亚群特征
细胞亚群相对频率分析发现斑块具有较多的CD8+ T细胞和较少的CD4+ T细胞（图4 f），证实了斑块中富集更多的CD8+ T细胞。无偏聚类显示斑块分为4个亚群（图4 d），其高表达CD69（早期激活和组织驻留标记物）（图4 e）。其中3个是CD8 +亚群（MC10、MC11和MC20），1个是CD4+亚群（MC12）。来自MC10的CD8+ T细胞高表达CD103 ，仅在硬化斑块中检测到，并对应于人类淋巴组织和非淋巴组织中报道的经典组织驻留记忆（TRM）T细胞。这首次确定该细胞类型存在于人类动脉粥样硬化动脉壁中。
作者还发现MC11、MC12和MC20亚群的T细胞相比于血液，硬化斑块中高表达PD-1（T细胞活化的负调节剂和T细胞衰竭的标记物）（Science, 2017），这表明这些亚群可能会同时响应于斑块慢性炎症而引发的T细胞耗竭重编程。
3 CITE-seq分析揭示动脉粥样硬化患者T细胞与巨噬细胞在斑块和血液中的功能差异
为了进一步解释斑块组织和血液中免疫分子机制和信号传导途径的关键差异，作者对斑块和血液中的T细胞和巨噬细胞进行CITE-seq分析。与之前的CyTOF结果一致，T细胞占硬化斑块免疫细胞的大部分，CD8+ T细胞在硬化斑块中比血液中更富集（图5 c）。
基因表达分析显示斑块T细胞表现出与T细胞活化、细胞毒性和T细胞衰竭相关的转录特征（图5 d），信号通路主要富集在炎症、细胞增殖和存活通路。相反，血液T细胞表达的基因通常会抑制T细胞功能（图5 e）。同时作者在亚群分析中发现血液中的T细胞大多呈静止状态，而在斑块中则表现出明显的活化状态，这表明斑块中T细胞功能在持续性炎症反应中逐渐丧失。
图5 血液和斑块组织CITE-seq分析中细胞分布(a-c)和T细胞差异表达基因分析(d-e)
斑块巨噬细胞的CITE-seq分析确定了五个不同的亚群，表明巨噬细胞也存在显著的功能异质性。基因表达分析显示亚群1、2和3与活化性和促炎性相关，亚群5具有泡沫细胞的转录特征（图6）。由此作者认为免疫细胞的功能失调是CV的诱因，T细胞和巨噬细胞在CV事件中扮演着重要角色。
图6 血液和斑块组织巨噬细胞差异表达基因分析
4 scRNA-seq分析解析SYM和ASYM患者硬化斑块中T细胞和巨噬细胞的功能差异
为了进一步研究T细胞和巨噬细胞的功能失调和CV事件的关系，作者对SYM和ASYM患者的斑块进行了scRNA-seq分析。作者首先分析了CD4+ T细胞，结果显示ASYM患者的CD4+ T细胞表现出细胞活化的转录谱和信号传导途径（IFNG途径，I型IFN信号传导）。此外，这些细胞还特异性的上调IL-1和IL-6信号通路（IL-1充当许可信号，可稳定细胞因子转录本并启用效应功能，而IL-6促进T细胞存活），而SYM斑块中的CD4 + T细胞并没有上调IL-1和IL-6信号传导途径。SYM斑块中的CD4 + T细胞显示出与T细胞迁移（RhoGTPase）、激活（PDGFR-β）和分化（Wnt35，IL-236）有关的独特信号通路（图7 a, b）。同时作者发现SYM的CD8 + T细胞中有一个亚群表现出激活IFN和T细胞衰竭信号通路的特征（图7 c）。由于T细胞衰竭的特征是对慢性炎症反应的非特异性抵抗功能的逐渐衰竭（Nature Reviews Immunology, 2015），这表明这些激活的T细胞启动了T细胞耗竭重编程。
图7 SYM和ASYM患者斑块中CD4+ T（a-b）、CD8+ T（c）和巨噬细胞（d）的差异表达基因分析。红色代表SYM，蓝色代表ASYM
巨噬细胞的差异基因分析显示，与SYM巨噬细胞相比，ASYM巨噬细胞具有更高的活化性和促炎性。SYM巨噬细胞通路分析包括促血管生成的IL-8和CXCR2信号，这两条通路涉及斑块的不稳定性，而Hedgehog和Wnt信号涉及的抗纤维化通路则可能和斑块不稳定性相关（图7 d）。
综上，作者结合单细胞蛋白质组学和转录组学揭示了与CV事件相关的斑块中新的免疫失调。SYM患者中两种T细胞谱系都呈现出与激活、分化和衰竭基本一致的基因表达特征，而ASYM患者的斑块中T细胞大多数被激活。
5 动脉粥样硬化患者斑块的细胞间相互作用
最后，为了探究ASYM和SYM患者硬化斑块中T细胞和巨噬细胞独特的功能状态，作者对细胞间相互作用进行了分析。首先对T细胞与T细胞间的相互作用进行探究，发现ASYM斑块中CD4+和CD8+ T细胞之间的配体-受体相互作用表现出促进其活化的促炎表型（图8 a）。在SYM斑块中，CD4+和CD8+ T细胞均表达PSEN1（可裂解斑块中T细胞表达的Notch受体），该信号可能有助于T细胞激活、分化及PD-1表达和细胞水解功能的调控。
T细胞与巨噬细胞的相互作用表明SYM斑块中T细胞可能通过与TLR结合的配体（VCAN）的表达激活巨噬细胞（TLR1 / 2），并导致斑块易损性（主要由于CCL5-CCR5相互作用导致）（图8 b）。巨噬细胞与巨噬细胞的相互作用表明ASYM斑块中的巨噬细胞间可通过自我招募和IL-1信号传导来诱导自我激活和促炎性相互作用，而SYM斑块中受损的巨噬细胞表达参与细胞迁移和炎症反应的趋化因子和细胞因子（图8 c）。
图8 SYM和ASYM斑块之间差异表达的配体-受体相互作用
结论与展望
该研究联合CyTOF、CITE-seq和scRNA-seq三项技术绘制了人类首个动脉粥样硬化斑块的单细胞免疫图谱，并确定了CV事件相关的特定免疫失调。同时，作者确定了斑块T细胞类型的异质性及其对应的特化功能。与血液相比，斑块中的T细胞活化、分化和耗竭能力增强。另外，硬化斑块中高表达PD-1的T细胞发生耗竭，这表明PD-1抑制剂可能会激活斑块中的这类T细胞。由于斑块T细胞活化可能会加剧动脉粥样硬化，PD-1抑制剂的治疗可能会对患有CV疾病的患者适得其反。最后，作者还强调未来的心血管疾病监测应着重检查免疫抑制剂对CV患者的副作用，这对改善临床药品的选用和心血管疾病监测具有重要意义。同时该研究也将为动脉粥样硬化这一老年常见疾病的治疗提供了新思路。
参考文献：
[1] Tabas I, Lichtman A H.Monocyte-Macrophages and T Cells in Atherosclerosis[J]. Immunity, 2017,47(4):621-634.
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