現在病原微生物的檢測方法豐富多彩。我們常規檢測的病原，可以針對病原本身去檢測，如使用顯微鏡，直接檢測病原（如細菌、真菌等），但是在臨床工作中應用局限，不適用病毒檢測。還有一類是培養法，常規的細菌、真菌都可以採用培養技術，但是對於病毒而言，由於培養對實驗室條件要求較高，而且也無法滿足快速診斷的的要求，所以目前培養法在病毒診斷方面的應用較少，多用於科研實驗室。還有其他方法，比如抗原檢測（針對病原微生物）和抗體（針對人體對病原微生物的免疫反應）檢測。此外，最重要的，也是今天著重強調的分子生物學檢測方法。對於現在的感染性疾病而言，如果醫院想讓病原微生物診斷水平提高，儘可能滿足臨床需求，分子生物學檢測將會成為一個必不可少的手段。
從這張圖片看出，急性呼吸道感染性疾病主要侵襲年齡較小的嬰幼兒、學齡前兒童以及老年人，這些明顯是免疫力相對來說比較低下的人群。對於移植的患者、使用激素的患者或者血液病的患者，感染的幾率也將大大增加，這是由患者自身因素決定。
國內和國際上對於流感都很重視
美國CDC的數據告訴我們，2017-2018年，H3N2（甲型流感）是主要分離株，在全國範圍內，甲型流感占71.2％，乙型流感占28.8％。2018-2019年，H1N1病毒在早期相對來說較多，到後期H3N2病毒較多。
乙型流感（季節性）通常在季節性流感季節後期更常見。
在2018年和2019年，我國CDC也發布了《流行性感冒診療方案》，這些診療方案可以成為我們臨床工作中的指南。有關《流行性感冒診療方案（2019年版）》也有一些新推薦，抗原檢測方法、抗體檢測方法以及分子生物學檢測方法對臨床診斷的價值都做出了明確闡述，下面我將和大家交流這方面的內容。
為什麼流感的即時檢測非常重要？
流感病毒的及時確診有利於及早啟動抗病毒治療，提高流感治癒率、降低病死率。如果治癒率提高，早期採取相關措施可以避免下一步發生細菌或真菌引起的相關感染。流感患者一旦發病，應儘快開始抗病毒治療，理想情況是症狀出現48h內開始。越早啟動抗病毒治療臨床獲益越大，對於發病超過48h患者，仍支持啟動抗病毒治療。
如果想在48h內開始抗病毒治療，我們就必須應用早期快速診斷，力求準確。呼吸道病毒診斷做抗體檢測或者培養在臨床診斷中價值不高，前者影響因素太多（如產生抗體的時間窗較長，受人體自身免疫狀況影響較大），後者很難滿足即時檢測的需求。由於早期病毒量相對來說較低，需要更靈敏的方法去檢測。目前這種靈敏的檢測方法通常指分子生物學檢測方法，醫學工作者或多或少的接觸過分子生物學，一般來說我們會做將目標核酸片段擴增30~40個循環，使原始樣本里含有少量的病原被放大後，得到準確的診斷。
在很多場合與臨床醫生交流的時候，很多醫生擔心分子生物學檢測方法的假陽性率是不是太高？我們在此回顧一下分子生物學在國內應用的歷史，在20世紀90年代，的確對分子生物學的管控不是很嚴格，應用十分混亂。方法學也沒有採取現在常用的螢光定量PCR方法。那時主要將相應的核酸片段擴增出來後，電泳，觀察條帶，這就是一個開放性的體系，很容易引起環境污染和交叉污染。直至2002年，衛生部發布了《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》，如果醫療保健機構或者是從事病原微生物實驗的單位想開展分子生物學檢測，必須嚴格按照衛生部規定執行。對於操作條件與房間等硬體有一定的要求，對於試劑和相關儀器有特殊規定，對於人員也有相關培訓，要求拿到證書後才能進行相關檢測。自從執行這些措施以及檢測方法的不斷進步，分子生物學檢測方法（如螢光定量PCR）的特異性和靈敏度都有很大提升。所以今天我們不應該對它的假陽性存疑，其準確度非常高，假陽性率相對較低，這些技術正廣泛地應用在病原微生物診斷領域。
其實不僅是病毒，還有許多病原微生物的檢測，包括細菌、真菌、寄生蟲、耐藥基因，未來如果想要解決快速準確檢測的話，有相當一部分會依賴分子生物學檢測方法。我們更多、更廣泛或者更早期的利用分子生物學檢測方法的話，會給不同領域的醫生提供一個非常有效的診斷感染性疾病的手段，這是今天特別想要表達的一個觀點。
流行性感冒診療方案（2018年版修訂版）
流行性感冒診療方案（2019年版）
2019年版的《流行性感冒診療方案》也做了相關推薦，其中推薦抗原檢測的方法，包括膠體金方法。由於分子檢測的可及性低，很多基層醫院缺少核酸檢測，抗原檢測方法因其快速方便，比較普及；應注意的是，抗原診斷靈敏度較低，但特異性高，所以在一些基層醫院可以使用。分子生物學檢測方法的靈敏度和特異性都比較好，條件允許時，應儘可能的採用這種技術。而病毒培養的方法，前面已經提到，運用在臨床工作中比較困難，不太推薦使用，在科研工作中應用的比較廣泛。
至於呼吸道病原抗體檢測的方法，由於抗體產生受時間影響，一般一周左右產生能夠檢測到的抗體，用於臨床診斷會存在很大問題。另外，抗體受人體自身因素的影響，有些患者特別是一些老年人、免疫力低下人群產生的抗體水平低於檢測限，可能不足以診斷，而且有些患者，某些抗體在體內一直處於較高的水平，或者非特異抗體產生干擾。這些因素都決定抗體檢測的方法並不適用於診斷流感。其實不僅是流感病毒，大多數呼吸道病原依靠抗體檢測來診斷可靠性差，可以將有效的精力、資金花費用在抗原檢測或者分子生物學檢測。抗體檢測在臨床中比較適用於慢性真菌感染或布魯菌感染等，其他如結核分枝桿菌感染均不適用抗體檢測方法。
檢測樣本採集有哪些注意事項？
流感病毒和一些非典型病原體（比如肺炎衣原體或者鸚鵡熱衣原體等），以及病毒不能獨立存活繁殖，多存在於粘膜上皮細胞內。因此我們要注意，流感病毒感染，採樣的時候就不能輕描淡寫的在相應部位輕輕的沾一下，建議稍微用力採集到呼吸道上皮細胞。脫落的上皮細胞可見於所有呼吸道分泌物。強調使用分子生物學方法檢測，最主要的一點就是分子生物學檢測的靈敏度高，即使原始樣本中病原量少也可以檢測出來。另外，應注意，有些病原在健康人群是很少存在定植的情況，一般認為健康人群少見甲流、乙流病毒定植，所以在就診人群中一旦檢測出來，同時患者有相關症狀的話，即可確診。其他的呼吸道病毒，比如鼻病毒或呼吸道合胞病毒，在健康人群是有少量定植的，特別是兒童，這時要根據半定量結果，再結合患者本身的症狀和免疫狀況綜合判斷。
臨床症狀的嚴重程度和病毒量有關，這也解釋了為什麼說最好不要僅報告一個陰性或陽性的結果，建議分子生物學檢測時，報告一個半定量的結果或者在未來隨著技術的推進，能夠報告一個定量的結果（如採用數字PCR技術），報告樣本里含有病毒的量。對於微生物實驗室或分子生物學實驗室的工作人員來說，由於採集呼吸道樣本的時候難於準確定量，可報告給臨床一個CT值，即在螢光定量PCR中，擴增曲線開始增高的循環數，CT值越小，說明原始樣本的病毒量越高。病毒量與病情相關，最初2-3天達到高峰。當然，有些分子生物學方法，如恆溫擴增、擴增產物電泳法檢測，是無法提供定量或半定量結果的。
流感病毒實驗室檢測，樣本類型可包括鼻腔分泌物、鼻腔沖洗液、鼻咽拭子、咽拭子、咽沖洗液。
一般而言，咽部採集樣本病毒量略低。分子生物學比較靈敏，因此應用的樣本種類比較廣泛。而抗原檢測的靈敏度不高，所以有時如果不是在病毒量高峰時採樣或者不是採集的鼻咽部拭子，而只是咽拭子，尤其是醫生、護士或者其他相關醫療人員沒有嚴格按照操作在咽部轉動3~5周，略微用力的話，都可能導致陽性率下降，患者可能是感染患者，但是沒有檢測出來。
下呼吸道樣本，包括痰液、氣管吸出物、Balf，都可以檢出病毒。如果懷疑肺炎，從口咽部到下呼吸道採樣也可以反映出來。一旦檢出，強烈指向患者存在相關部位感染。
因為甲流、乙流以及呼吸道合胞病毒與腺病毒、巨細胞病毒、EB病毒不同，為RNA病毒，容易被環境中RNA酶降解，建議保存於特定樣本保存液中送檢，其中含有抑制RNA酶的成分，能夠減少RNA降解，提高檢出的陽性率。
最佳的採樣時機是什麼時候？
在感染急性期採集樣本陽性率高，分子生物學檢測方法和抗原檢測方法均適用。由於分子生物學檢測核酸，靈敏度高，所以不同樣本類型與轉運、保存方式對檢出率影響較小，可是對於病毒載量的檢測有影響，報道半定量的時候會有影響，但是對於報陰性、陽性的影響較小，但是，應嚴格按照廠家提供試劑說明書的採樣、轉運與保存要求操作，避免漏檢。如果有些實驗室周末不做檢測，需要48h保存，必須放在保存液里，2-8℃保存，或者有時候需要冷凍在-80℃的條件下，如果無法達到這麼低的溫度，至少要-20℃。當然，不同試劑可能有不同的要求，需根據試劑的說明書操作。
採集哪些樣本進行檢測？
採樣的時候要注意，做分子生物學檢測、抗原檢測或者培養時，是針對病原本身的，採集到距離感染部位越近的樣本，檢測陽性率會越高。而抗體主要在血液里產生的，絕大多數情況下抗體檢測採取血液即可。對於下呼吸道感染而言，理論上來說留Balf是最好的選擇。流感病毒在鼻咽部載量最高，如果不適合留取Balf，直接在鼻咽部採樣，也可以很好地檢測病原。從上圖看出，很多指南都推薦鼻、鼻咽部、咽部的樣本。
呼吸系統不同部位的病毒濃度有所不同
不同的鼻咽拭子類別，可影響樣本中的抗原、核酸等數量，致檢測結果不穩定。多數呼吸系統病毒主要複製部位是後鼻咽部纖毛上皮細胞，其次是前鼻孔與口咽部纖毛上皮細胞，所以也就是剛才建議採集的時候要稍微用一點力，要採集到相應部位，不能執棉簽在口腔輕輕一轉，這樣有可能根本就沒有採集到病毒或者採集的病毒量非常少，僅蘸到一點口水，低於檢測標準，結果成假陰性。
最好採集哪種樣本類型？
樣本類型最好去採集鼻咽拭子或鼻拭子，操作如上圖，患者會略有不適，因此應選擇比較柔軟的拭子，多數試劑廠家在提供試劑時會提供相應採樣拭子。不能採用木棍的棉拭子直接伸進鼻子或咽部採集樣本，患者會比較痛苦，舒適度差，且不易到達有效部位，陽性率相對下降。
樣本採集如何操作？
通常後鼻咽部的拭子所能沾取的病毒量高於前鼻或咽部拭子；將柔和、頭部尖的拭子由鼻腔插入，沿鼻腔壁伸入鼻咽部，直至感覺到一定阻力，轉動3-5次，然後將該拭子取出，進行抗原檢測或者相應的分子生物學檢測，如果不能及時進行分子生物學檢測，要放在RNA保存管中。如果是咽拭子，直接在咽部採集即可。特別是在兒科就診的患者，或者患者的特殊情況，采鼻咽拭子存在一定難度，如果使用分子生物學檢測的手段，或者預判患者的病毒載量比較高的情況下，即使用抗原檢測，也可以采咽拭子。注意采咽拭子時不要在口腔內隨意比劃一下，可能僅沾到一點兒唾液，需在後咽部稍微有力度的轉3-5次，是比較理想的採樣方式。
採樣拭子對於檢測結果的影響
拭子：用於呼吸系統病毒檢測的拭子材料就為聚酯纖維、滌綸或人造絲，用塑料柄；注意含藻酸鈣拭子對於核酸擴增酶的抑制作用。
現在有些試劑廠商基本在提供試劑的時候也會提供配套的拭子，分子生物學檢測方法的廠商會提供相應的保存液，使用廠商提供的配套產品即可。
不同的病毒在什麼時候病毒載量可以達到高峰？
出現症狀後什麼時候採集的時機最好？從圖中看出2-3天病毒量比較高，隨著時間的推移，排出的病毒量會逐漸下降。但即使下降，患者真的存在病毒感染的話，目前來說只要採樣得當的話，一周之內，分子生物學檢測基本可以有一個比較理想、令人滿意的結果。
圖片來源於王輝教授的PPT
這張圖片很好的表達了分子生物學檢測的方法。RT指反轉錄，流感病毒是RNA病毒，轉化為cDNA，然後再進行下一步PCR過程。現在也有不同的檢測方法，可以直接擴張RNA。如圖所示，患者感染後產生抗體的時間較長，且受患者自身免疫狀況的影響，2019年的指南也已明確表明，抗體檢測不能夠作為流感診斷的依據。
不同檢測方法的比較
膠體金
圖示為快速抗原檢測的方法學之一，膠體金檢測。其原理就是如果樣本中如有相對應的抗原，與試劑板中包被的抗體結合，抗體上面標記的物質呈現顏色變化，出現對應條帶，我們通過觀察條帶可以得到相關的檢測結果。這個方法在臨床應用中操作簡便，不需要特殊儀器；速度快，10-15min就可以拿到結果；可以做床旁檢測。
也有採用螢光標記法進行抗原檢測。一般螢光標記法會比膠體金標記的方法更加靈敏，多需相應儀器，如螢光顯微鏡，螢光檢測設備，相對而言它的靈敏度介於普通的膠體金檢測和分子生物學檢測之間。
膠體金檢測的劣勢就是敏感性較差，如果患者的病毒載量較低、發病時間較長，或者採到樣本量少，可能檢測陰性。文獻對不同試劑報道的敏感性也有所不同，不同試劑存在很大差異，最低的可能為10%左右，最高的也不會超過70%。
免疫螢光法
抗體檢測的方法，之前應用的比較多，但隨著我們認知的逐漸提高，在2019年的流感推薦方案中已經很明確這種抗體檢測的方法不適用於診斷流感，其實不僅是不適合流感的診斷，大多數呼吸道病毒都不需要這種抗體檢測方法。
分子生物學檢測方法
現在分子生物學發展迅速，很多國內的廠商意識到這一點，逐漸向國外靠攏。實際上國外在許多病原學診斷都會廣泛應用分子生物學檢測。
在國內，比較簡單的一類是建立一般分子實驗室，按照不同的項目分別檢測。做多重檢測的比較少。因為核酸提取與擴增步驟分離，所以耗時較長。
還有一類是全自動的檢測方法，只需將樣本放入試劑盒，相當於一個小型分子生物學實驗室，把試劑配置，樣本中DNA或RNA核酸提取，核酸擴增與檢測整合到一個小小的平台上。
常可實現多得檢測。所謂多重檢測就是多種引物和探針混合，檢測出多種病原，比如FilmArray，一個呼吸道檢測試劑盒一次性可以檢測將近33種靶標，包括細菌、常見的病毒、主要的耐藥基因，2h即可以拿到結果，但是在國內還沒有上市。
還有Xpert分子檢測平台，目前主要是做結核分枝桿菌與利福平耐藥的檢測，同時可以報告是否有結核，是否有利福平耐藥。也是一個全自動檢測平台，僅需把樣本放在試劑盒，即可完成DNA或RNA核酸提取、核酸擴增和產物檢測的過程。除了做結核外，這個平台還可以做很多檢測項目，包括金黃色葡萄球菌、艱難梭菌等。現在已經上市的基於Xpert平台的甲流檢測、乙流檢測以及呼吸道合胞病毒檢測，可以在20~30min內拿到結果。
實際上臨床更需要這種全自動、多重的檢測手段，如果國內的各個廠商對這方面比較重視，國內有自己產品的話，就可以將相關成本大大的壓低，惠及更多患者，使流感病毒和其他呼吸道病毒的診斷提升到一個新水平。
當然，分子生物學也有核酸探針雜交的方法，不需要擴增，因而檢測速度較快，但靈敏度不如螢光定量PCR。
傳統PCR
傳統PCR需要一個PCR實驗室，要嚴格管理，有試劑製備區、樣本處理區、核酸擴增區、產物分析區。傳統PCR具有高靈敏性和特異性的優點，但它的操作步驟繁瑣，耗時長，3-4h；需積攢標本，一般在隔天或2-3天後獲取報告；需要特殊實驗室設備和訓練有素的人員。
即時分子診斷技術
全自動的分子生物學檢測平台，不僅限於上述設備。歐美國家此類產品較多。目前我還沒有看到國內有比較好的全自動快速多重核酸檢測平台的出現，我們特別希望有這樣平台出現，能夠解決國內的相關問題。
圖示為Xpert甲流-乙流-呼吸道合胞病毒試劑盒。探針覆蓋多個位點，保證檢測的靈敏度。
如果考慮到流感的變異性強，存在變異或者不同亞型，試劑需要覆蓋不同的區間、不同的片段。Xpert主要是覆蓋病毒多個靶點，靈敏度和特異性相對較高。
- 多重探針靶向基因不同位點
- Filmarry採樣流程
流感檢測技術TAT時間比較
不同檢測方法的檢測周期存在差異。理論上來說，現在做全自動的多重PCR檢測完全可以替代抗原檢測，因為抗原檢測主要特點是速度快，10-15min就可以拿到結果，但是如果有好的分子生物學全自動檢測設備，30min拿到結果是完全可以做到的，我們需要這種檢測方法來替代抗原檢測的方法，現在很難實現，因為國內沒有相應的平台，我們就要使用國外試劑的平台，相對來說成本較高或者是對於儀器的要求也比較高，那麼基層醫院就很難滿足。
我們不可能要求大家都去使用分子生物學檢測方法。抗原檢測的靈敏度雖然較低，但是特異性不錯，如果檢出陽性並且患者有相應症狀的話，診斷是沒有問題的。但如果懷疑患者有甲流、乙流或其他呼吸道病毒感染的話，做抗原檢測的結果為陰性，是不能排除診斷的。
病毒性肺炎（Viral pneumonia）
常見的呼吸道病原體（DNA病毒、RNA病毒）以及非典型病原體（如衣原體、支原體）等，種類並不是很多，所以非常適合多重PCR檢測，同時檢測十幾種甚至二十幾種病原，是可以涵蓋這部分比較常見的呼吸道感染病毒和非特異性病原體的，甚至如果做的比較好，拓展到細菌的檢測，還可以把部分臨床很難培養出來的細菌涵蓋，比如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌，這些細菌在臨床使用了抗生素後，培養陽性非常困難。我們有時候僅靠臨床症狀和臨床經驗很難區分病毒感染和細菌感染，需要更多的分子生物學或更靈敏的檢測手段介入。
一定要明確定植和感染的概念
從這張圖可以看出，部分病毒會在健康人體中檢測出來，但是有些病毒就不會檢測出來，這就涉及到定植和感染的概念，我們一定要明確這兩種概念。尤其在今年，很多醫生都去做宏基因組測序等，有多種微生物檢測出來的話，拿到結果後一定要分析是感染還是定植，否則在以前，由於沒有檢測手段時，檢不出病原，導致濫用抗生素，但是現在用宏基因組測序得到的答案太多了，可能檢出10餘種微生物，如果拿到一個微生物就考慮使用抗生素，而不甄別定植與感染，那這就是另一種形式的抗生素濫用，報告的正確解讀非常關鍵。
總體而言，作為一名臨床醫生、感染科醫生或者微生物實驗室工作人員，專業上對患者病情的判斷應該更勝於某種技術的進展。無論何時我們都不能完全依賴技術，我們要知道它只是一種技術與工具而已，個人專業水平的不斷提高，才能更好地利用工具。
這張圖片告訴大家，在診斷的時候，僅有定性結果可能是不夠的，不希望只有一個陰性或陽性的結果，更多的是希望做到定量的水平，哪怕是半定量的結果。
我們也要關注流感併發症的問題
在免疫受損的情況下，很多在呼吸道正常定植的病原都有可能成為繼發感染重要的病原體，比如金黃色葡萄球菌主要定植的來源為鼻部；肺炎鏈球菌在鼻咽部定植的也很多；還有A組鏈球菌在國內並發感染好像沒有引起更廣泛的重視，尤其在成人這方面，但是美國非常關注，對此有長期監測。同時我們還要關注健康人群定植的病毒，比如EB病毒、巨細胞病毒，這些都有可能隨著免疫力下降，成為下一步感染的主要病原。
近幾年也特別關注麴黴菌感染
麴黴菌在部分人群呼吸道是有可能定植的，不是任何時候檢測出來麴黴菌都意味著感染，尤其是現在宏基因組測序做得比較多，會檢測出各種各樣的麴黴菌、橫梗霉、根毛霉等，一定要結合患者的症狀、免疫狀況、影像學結果與其他指標進行綜合判斷。
麴黴菌是流感後繼發感染的重要病原，應予以關注。現在微生物實驗室對於細菌檢測的能力相對來說較好，但是對於真菌檢測的能力以及病毒檢測的能力，如果沒有建立好微生物實驗室全面建設，沒有很好的血清學檢測方法，沒有很好的真菌培養方法，或者沒有很好的分子生物學檢測方法的話，對於這些除了常見細菌外的病原檢測，只是一句空話，很難明確臨床診斷，治療無的放矢，很難對患者病情的走向給予合理的判斷。
ABX推薦RT-PCR技術
《流行性感冒診療方案（2019年版）》中，對於實驗室檢測方案有非常明確的說法。不要使流感在早期有檢測手段、治療方案、抗病毒藥物的時候，因為沒有及時應用而導致後面發生一系列的慘劇。希望我們能夠落實指南中的推薦方案以及處理措施，及早明確診斷，減少併發症的發生，為患者造福，這是我們最美好的理想。
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專家介紹
魯炳懷
中日友好醫院呼吸與危重症科二部臨床微生物與感染實驗室，主任醫師，副教授，醫學博士，碩士生導師。中華醫學會檢驗分會微生物學組委員，中華醫學會熱帶病與寄生蟲分會青年學組委員，中國微生物學會醫學微生物學與免疫學專委會真菌學組常委委員，華人藥敏試驗委員會委員，北京醫學檢驗學會理事。
本文完
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本文由呼吸界編輯 大奔 整理、排版，感謝魯炳懷教授的審閱修改！