女主人公杜丽娘长得天生丽质而又多情善感。
她到了豆蔻年华，正是情窦初开的怀春时节，却为家中的封建礼教所禁锢，不能得到自由和爱情。
忽一日，她那当太守的父亲杜宝聘请一位老儒陈最良来给她教学授课，这位迂腐的老先生第一次讲解《诗经》的“关关雎鸠”，即把杜丽娘心中的情丝触动了。
数日后。杜丽娘到后花园踏春归来，困乏后倒头睡在了床上。不一会见一书生拿着柳枝来请她作诗，接着又将她抱至牡丹亭成就了云雨之欢。
待她一觉醒来，方知是南柯一梦。此后她又为寻梦到牡丹亭，却未见那书生，心中好不忧闷。渐渐地这思恋成了心头病，最后药石无治竟然死去了。
其父这时升任淮扬安抚使，临行将女儿葬在后花园梅树下，并修成“梅花庵观”一座，嘱一老道姑看守。
而杜丽娘死后，游魂来到地府，判官问明她至死情由，查明婚姻簿上，有她和新科状元柳梦梅结亲之事，便准许放她回返人间。
此时书生柳梦梅赴京应试，途中感风寒，卧病住进梅花庵中。
病愈后他在庵里与杜丽娘的游魂相遇，二人恩恩爱爱，如漆似胶地过起了夫妻生活。
不久，此事为老道姑察觉，柳梦梅与她道破私情，和她秘议请人掘了杜丽娘坟墓，杜丽娘得以重见天日，并且复生如初。
俩人随即做了真夫妻，一起来到京都，柳梦梅参加了进士考试。
考完后柳梦梅来到淮扬，找到杜府时被杜巡抚盘问审讯，柳梦梅自称是杜家女婿，杜巡抚怒不可遏，认为这儒生简直在说梦话，因他女儿三年前就死了，如何现在能复生，且又听说女儿杜丽娘的墓被这儒生发掘，因而判了他斩刑。
在审讯正吊打之时，朝廷派人伴着柳梦梅的家属找到杜府上，报知柳梦梅中了状元了。
柳梦梅这才得以脱身，但杜巡抚还是不信女儿会复活，并且怀疑这状元郎也是妖精，于是写了奏本让皇上公断，皇帝传杜丽娘来到公堂，在“照妖镜”前验明，果然是真人身。
于是下旨让这父子夫妻都相认，并着归第成亲。一段生而复死，死而复生的姻缘故事就这样以大团圆作了结局。
万历二十八年（1598年），汤显祖辞官，回到家乡江西临川县的乡村闲居。这一年他49岁。他在生活中耳闻目储了一些青年男女的爱情遭遇，这些经历激起了他的创作感情。回乡不久，他就开始了《牡丹亭》的写作。
在明朝初期，由于各地方语言、风俗以及传统音乐的差异，传奇剧可以说是诸腔竞作，包括了大量风格各异的地方声腔。到了明朝中期，南曲中最为盛行的四大声腔为：“海盐腔”、“余姚腔”、“弋阳腔”、“昆山腔”。嘉靖、隆庆年问，以魏良辅为代表的一批戏曲音乐家，对昆山腔进行了成功的全面改进。
在唱曲的板眼、宫调等方面，伴奏方面，气韵和平仄的使用方面，将昆山腔进行重新的规划整理，创立了一种清新典雅的声腔风格，时称“水磨调”、“冷板曲”。 《牡丹亭》就采取了由海盐腔衍化而来的宜黄腔为基础写作。 《牡丹亭》据明人小说《杜丽娘慕色还魂》改编而成。
在汤显祖的《牡丹亭》中，至情化身的杜丽娘形象，在作品中呈现出“生而有情，因情成梦”的生命存在状态，这种深厚、真挚而坚定的情感使杜丽娘的形象绽放出思想解放与生命自由的人性主义光辉。自幼在严苛管教与约束中成长的杜丽娘，虽然鲜少与外界接触，但来自书籍中男女相恋的故事仍然使杜丽娘这位青春少女因憧憬爱情这一自然情感而萌动春心。
由此可见，封建礼教统治下的封闭式教育妄图压制摧残人的天然欲望的目标，在人性光辉的照耀下是很难达成的。作品中流露的女性生命意识不仅造就了杜丽娘青春意识与情感意识的觉醒，更是在杜丽娘的精神世界引发动荡，促使丽娘走上打破封建礼教束缚、追求自由爱情的个性解放之路。
汤显祖人文主义情怀的体现正是随着杜丽娘对爱情不懈追求而逐渐深刻的。如果汤显祖仅仅将杜丽娘塑造成偶然“慕色怀春”的少女的话，恐怕《牡丹亭》的艺术高度将会大打折扣。杜丽娘最可宝贵之处就在于即使肉身已死、香消玉殒，但仍在死后执着地寻觅追求自己所坚持的爱情理想。汤显祖再次用超浪漫主义的表现手法刻画了生而死、死而生仍追求爱情的杜丽娘形象，而这一形象是对其所推崇的人文精神的最佳诠释。