2. 材料和方法

2.1. 试验对象及研究设计

总共30名受试者（男性13名，女性17名，平均年龄52.9±10.6岁）诊断为NAFLD并纳入本实验，在基线和8周时接受评估。本实验的纳入标准包括脂肪变性的USG（超声检查）或增加的丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、γ-谷氨酰转移酶（GMT）、超重/肥胖以及一份包含生活方式危险因素（20个问题）的问卷，同时排除其他病因引起的肝病。目前接受过治疗的癌症患者、通过生物治疗积极治疗的类风湿性疾病患者、活动性结核病、急性呼吸道疾病或急性胃肠炎患者均被排除在外。所有NAFLD患者的整个实验组常规使用相同药物（抗高血压药物、抗糖尿病药物、降脂药物）而不作任何改变。研究中没有参与者的配偶或配偶参与本研究。所有参与者均获得书面知情同意，试验按照《赫尔辛基宣言》进行。该研究由斯洛伐克布拉提斯拉发地区伦理审查委员会批准（NCT 05325398）。表1显示了受试者的基线人体测量数据。

所有入选患者以双盲方式随机分为两组，其中患者食用氢气组（氢气组；n=17）或非氢气组（安慰剂组；n=13）（图1）。随机化由计算机随机数发生器进行。该序列是通过M.S.最小化过程产生的。富氢水组的患者接受了氢生产片剂，该片剂能够通过元素镁和有机酸之间的水性反应用氢气富集常规水（Drink 富氢水 and Natural Wellness Now Health Products股份有限公司，温哥华，BC，Canada），如前所述。安慰剂组的患者接受了外观和成分相似的片剂（即碳酸镁、柠檬酸、碳酸氢钠、菊粉、Kollidon 30、富马酸硬脂酸钠），其中产生了CO2（g）而不是氢气（g）（Drink 富氢水 and Natural Wellness Now Health Products股份有限公司，温哥华，不列颠哥伦比亚省，加拿大）。所有小组均被指示将一片片剂溶解在330毫升水中，等待溶解并立即饮用产生的富氢水（氢气>4mg/L），每天三次，持续两个月。在实验开始和结束的前一天晚上禁食后，在早晨（上午8点之前）将血浆收集在柠檬酸钠溶液中。收集的血液通过离心分离（在4°C下以3000×g的速度离心10分钟），并立即储存在-80°C下，直至分析。

Figure 1 CONSORT flow diagram.

2.2. 临床生化/血液学参数

所有生化/血液学参数（白蛋白、碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、C-反应蛋白、总胆固醇、高密度脂蛋白、甘油三酯）均由SYNLAB，布拉迪斯拉发进行测量。使用贝克曼库尔特公司的化学分析仪AU5812（美国加利福尼亚州布雷亚市）评估生化参数，ALT和AST采用国际临床化学联合会（IFCC）方法，碱性磷酸酶采用比色法，白蛋白采用BCG法。对于血脂参数（胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯），使用酶促CHOD-PAP和比色测试。CRP的测定采用免疫比浊法。

2.3. 氧化应激标志物

2.3.1. 丙二醛测量

丙二醛（MDA）分析使用TBARS试剂盒（产品编号700870，密歇根州安阿伯市的Cayman化学品公司）按照制造商的说明进行。简要地说，将100μL血浆与由乙酸、氢氧化钠和硫代巴比妥酸组成的彩色试剂溶液混合。将该混合物煮沸1小时，然后立即放在冰上10分钟。在4°C下以1600×g离心10分钟后，测量反应产物（MDA）在530nm处的吸光度（Synergy H1微量板读数器，加州圣克拉拉市的Biotek公司）。使用丙二醛作为标准品。

2.3.2. 8-羟基脱氧鸟苷测量

8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）通过酶联免疫吸附试验（ELISA）方法使用8-OHdG ELISA试剂盒（Elabscience，德克萨斯州休斯顿市；E-EL-0028）按照制造商的说明进行测量。简要地说，将50μL血浆与特异性针对8-OHdG的生物素标记检测抗体工作液混合，并在37°C下孵育45分钟。将溶液从孔中取出并洗涤三次。用相同的程序进行辣根过氧化物酶（HRP）偶联工作液和底物反应液（分别在37°C下孵育30分钟和15分钟）的处理。通过添加50μL终止液终止反应。在450nm处测量平板（Synergy H1微量板读数器，加州圣克拉拉市的Biotek公司）。

2.4. 乳酸脱氢酶测定

乳酸脱氢酶（LDH）活性分析使用乳酸脱氢酶活性测定试剂盒（密苏里州圣路易斯市的Sigma-Aldrich公司）按照制造商的建议进行。将2μL血浆与48μL LDH测定缓冲液和主反应混合液（由48μL LDH测定缓冲液和2μL LDH底物混合液组成）混合。使用标准NADH。将这种溶液和样品混合，在37°C下每2-3分钟测量一次450nm的光密度（Synergy H1微量板读数器，加州圣克拉拉市的Biotek公司），直到最活跃样品的值大于最高标准值为止。

2.5. 蛋白质印迹

蛋白质分析根据我们之前的研究（Kura等人，2019年）进行。用Laemmli缓冲液处理的血浆样本被应用于12.5% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶，通过电泳分离（120V），并转移到硝酸纤维素膜上。转移后的蛋白质通过Ponceau S溶液（密苏里州圣路易斯市的Sigma公司）可视化。膜印迹用TBS（1M Tris，5 M NaCl在水中，pH 7.4，吐温-20）洗涤，用5% BSA在TBS中封闭4小时，并与适当的一抗在补充表S1中指定的稀释度下孵育。然后将膜洗涤并用山羊抗山羊IgG、抗小鼠或山羊抗兔IgG与HRP结合的物质孵育1小时。再次用TBS溶液洗涤膜，然后施加发光团（发色团）、香豆酸和过氧化氢以引发化学发光反应。化学发光反应在Amersham Imager 600仪器（瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB，丹麦达尔马丁）中检测。从蛋白质印迹获得的所有数据都使用ImageJ软件版本1.8.0_172计算。

2.6. 明胶凝胶电泳测定基质金属蛋白酶活性

基质金属蛋白酶（MMPs）-2和MMP-9的活性通过在含有2 mg/mL明胶的10%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳来评估。将稀释后的血浆样本在不含2-巯基乙醇的Laemmli缓冲液中制备，加载到凝胶中而不进行变性。电泳后，用50 mM Tris-HCl（pH 7.4），含有2.5% Triton X-100洗涤凝胶，然后在37°C下在含有50 mM Tris-HCl、10 mM CaCl2和1.25% Triton X-100的底物缓冲液中孵育过夜。孵育后，用1% Coomassie Brilliant Blue G-250染色凝胶，然后用40%甲醇和10%乙酸洗涤。透明带表示MMP-2和MMP-9的胶原水解活性，背景为深蓝色。

2.7. 统计分析

根据可用性、意愿和统计上所需的最小样本量确定受试者招募的样本量。统计分析由JM使用R统计软件环境（www.r-project.org，访问日期：2021年7月11日）进行。所有显著性水平设置为α = 0.05。使用Shapiro–Wilk测试检验数据的正态性。如果测试拒绝正态性，则应用Mann–Whitney测试；否则，使用两个样本t检验。

3.试验结果

3.1. 受试者 本研究采用随机双盲安慰剂对照的方式进行。所有入选患者（13名男性和17名女性）来自斯洛伐克共和国的布拉迪斯拉发地区。安慰剂组的平均年龄为53.23岁（±9.13岁），氢气组的平均年龄为52.65岁（±11.9岁）。几乎所有患者都患有肥胖症，体重指数（BMI）的平均值在安慰剂组为32.8（±3.37），在氢气组为35.52（±4.03）。所有参与研究的患者均未出现不良反应并完成了试验。两组患者的血压水平均处于正常范围内。 在为期两个月的富氢水摄入后，几乎所有测量到的患者基本特征指标呈积极趋势：体重（减少）、BMI（减少）、收缩压（降低）。然而，这些测量结果并未显示出统计学意义（p>0.05）（表2）。

3.2. 富氢水摄入改善血浆生物标志物 我们使用临床生化/血液学实验室的标准生物医学和血液学方法测量了指示脂质水平和肝功能以及血液分析的生化参数。对于每个组别，我们将个体生物标志物的基线值与其在8周随访后的数值进行比较（表3）。 在两个组别中，天门冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）的非显著性下降幅度相似（p>0.05）。另一方面，两组的C反应蛋白（CRP）、白蛋白（ALB）、碱性磷酸酶（ALP）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和甘油三酯/高密度脂蛋白比率（TG/HDL）均有轻度增加（p>0.05）。除了CRP、TG、LDL和TG/HDL比率外，这些非显著性增加在富氢水组最为明显，而安慰剂组的增加更为显著（p>0.05）。相比之下，乳酸脱氢酶（LDH）水平在安慰剂组倾向于增加（2.63%），在富氢水组倾向于减少（5.98%）（p>0.05）。

3.3. 氧化还原状态生物标志物 如表3所示，MDA水平在安慰剂组倾向于降低，但在富氢水组倾向于增加，两组之间的差异达到统计学意义（p<0.05）。然而，富氢水组的后-MDA水平与安慰剂组的基线水平相当，分别为3.13±1.60和3.11±1.53。两组的8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）均有非显著性增加，但富氢水组的增加趋势更为明显。我们还监测了铜/锌超氧化物歧化酶（SOD1）的水平。如图2所示，安慰剂组的SOD1水平增加了约20±16.71%，而富氢水组的SOD1水平保持不变（增加约0.04±22.61%）。两组之间的差异达到统计学意义（p<0.05）。

图2 从基线到随访的相对百分比变化：SOD1。n=13（安慰剂组），n=17（氢气组），*p<0.05。

3.4. 炎症标志物和热休克蛋白 如图3所示，炎症标志物肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在两组中从基线到随访时均无显著变化（安慰剂组98.20±16.55%；富氢水组99.34±21.71%）。然而，核因子κB（NF-κB）在安慰剂组有非显著性增加趋势（101.23±12.62%），在富氢水组有非显著性下降趋势（99.41±15.15%）。类似地，热休克蛋白-60（HSP60）和HSP70在两组中均未发生变化。然而，HSP70在安慰剂组轻微增加（104.60±14.24%），在富氢水组轻微减少（99.90±19.14%），而HSP60在两组中均有增加趋势（安慰剂组101.92±18.06%；富氢水组102.37±16.02%）。

图3 炎症标志物（a）和热休克蛋白水平（b）。HSP60 = 热休克蛋白60；HSP70 = 热休克蛋白70；TNF-α = 肿瘤坏死因子α；NF-κB = 核因子κB。n=13（安慰剂组），n=17（氢气组），p<0.05。

3.5. 基质金属蛋白酶 我们发现血浆中的基质金属蛋白酶（MMPs），MMP2在安慰剂组和非显著性下降趋势（96.15±7.14%），在富氢水组也呈非显著性下降趋势（95.07±10.09%）。此外，MMP9在安慰剂组有增加趋势（103.67±8.89%），在富氢水组有下降趋势（97.12±8.36%），但差异仍不具有统计学意义（图4）。

图4 富氢水对基质金属蛋白酶的影响。MMP = 基质金属蛋白酶。n=13（安慰剂组），n=17（氢气组），p<0.05。

4.讨论

在这项随机、双盲、安慰剂对照的研究中，我们调查了高剂量氢水（即>12mg/天）对NAFLD患者8周的影响。由非显著改变的肝酶提示，氢水干预无不良事件。此外，研究对象对每天三次频繁消耗氢水有良好的耐受性。

在这项为期8周的研究中，安慰剂组有体重增加的趋势(≈0.23公斤)，相反，氢水组出现了体重下降的趋势，平均体重减少了≈1公斤。虽然体重的变化没有统计学意义，但与安慰剂组相比，氢水组的BMI有统计学意义上的显著降低。这些体重和BMI的改善可能具有临床意义，特别是考虑到我们研究的短期持续时间。这些结果与我们之前的研究结果一致，即代谢综合征患者使用高浓度氢水24周后，体重和BMI显著降低。

在氢水组中，我们发现收缩压下降的趋势(≈2mmHg)，但没有达到统计学意义。这可能是由于研究的短期持续时间和对象的血压相对正常。例如，舒张压低于80mmHg，收缩压处于高血压前期标准的低值。尽管2mmHg的收缩压下降没有统计学意义，但它可能具有临床意义。事实上，一项荟萃分析发现，休息时收缩压降低2mmHg可使冠心病死亡率降低4%，中风降低6%，所有原因所致死亡降低3%。

我们还观察了氢水对肝功能和胆固醇的各种生物标志物的影响，并观察到这些领域的益处。然而，与其他研究相比，这些参数的变化没有达到统计学意义。需要进一步的研究来证实这些观察结果并确定潜在的机制。

我们还研究了富氢水对肝功能和胆固醇的各种生物标志物的影响，并观察到这些领域的有益趋势。然而，与其他研究相比，这些参数的变化仍然不明显，这可能是由于以下原因：（i）这些值已经处于稳态/范围内，或（ii）研究持续时间较短。我们之前对代谢综合征患者进行的为期六个月的调查显示，许多这些参数都有所改善，这与其他的临床报告相符。例如，与安慰剂组相比，富氢水具有增加HDL胆固醇的重要趋势。此外，富氢水减轻了两个月内TG水平的上升。这些对TG和HDL的影响导致富氢水组与安慰剂组相比，TG/HDL比值明显更高（即分别为3.64和4.25）。也就是说，安慰剂组增加了11.2%，而富氢水组仅增加了0.55%。TG/HDL比值越高，冠状动脉疾病的风险就越大，这也是全因死亡率的独立预测因素。尽管有这些有利趋势，但与以前的研究相比，绝对变化并不大，因为以前的研究中基线胆固醇水平明显升高。在我们的研究中，总胆固醇仍低于200mg/dL，对于年龄相似的受试者，大型前瞻性队列研究表明TC水平低于200mg/dL与死亡率增加有关。由于胆固醇水平和健康可能遵循反向U形曲线关联，因此测试富氢水给药对胆固醇水平较高（如>250mg/dL）人群的影响将是有趣的。

据报道，氢气在细胞、动物和人体临床研究中具有抗氧化作用[4]。与基线相比，安慰剂组SOD1水平略有增加，富氢水组保持不变。有趣的是，我们观察到富氢水组MDA（≈17.2%）和8-OHdG（≈8.3%）略有增加，但差异无统计学意义，而这两种物质是氧化应激的标志物。这些增加远小于剧烈运动后诱发的增加。例如，在受过训练的男性跑步者中，进行一次自适应的21公里跑，强度为最大摄氧量的77%，之后MDA增加了约11.5%，而进行60分钟类似的强度运动后，尿8-OHdG增加了约276%。这些数值应与慢性疾病和病理条件下经常报告的百分之几百的增加进行比较。此外，与运动或氢气不同，在疾病状态下，氧化应激持续升高，导致抗氧化剂消耗和细胞损伤。我们发现，服用富氢水后，LDH水平降低了约6%，这可能表明其具有保护作用，正如先前所证明的那样。

除了已知的抗氧化作用外，氢气还被证明具有选择性抗炎作用。然而，与之前的研究相反，我们的结果表明TNF-α没有变化，只有富氢水略微降低NF-κB的趋势。热休克蛋白（HSP）可以被炎症上调；因此，我们观察到HSP60或HSP70没有变化。然而，HSP70与NF-κB水平有相似的趋势，即它们在安慰剂组中趋于增加，在富氢水组中趋于减少。同时，我们发现由炎症调节的MMP-2和MMP-9也没有明显变化。然而，MMP-9在安慰剂组中有适度增加的趋势，在富氢水组中有适度减少的趋势。这与之前的研究结果一致，表明富氢水通过抑制MMP-9和MMP-2有效地减少了平滑肌细胞的迁移。MMPs的血清表达与肝损伤标志物的血清水平相关，在两组中均没有显著变化。这增加了富氢水对MMPs无效作用的可能性，这可能是由于与MMPs被更大刺激显著上调的研究相比，NAFLD受试者中富氢水的表达较低。

富氢水已显示出缓解许多疾病病理学的希望，包括COVID-19，由于其抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。在饮食诱导NAFLD的动物模型中，富氢水有效地改善了体成分并减少了肝脏中的脂质积累。这些益处至少部分通过富氢水诱导的乙酰辅酶A氧化酶、脂联素水平的上调，CD36表达的减少以及炎症标志物TNF-α和IL-6的表达减少来实现。这与表明富氢水在动物模型NAFLD中的有益作用的其他研究一致。此外，对12名NAFLD患者进行的为期28天的双盲、安慰剂对照交叉试验表明，富氢水显着减少了由双回波MRI评估的肝脏脂肪积累。然而，与我们的研究类似，没有发现代谢谱的统计学显着变化。

我们之前在60名代谢综合征患者的双盲、安慰剂对照研究中证明，连续六个月给予高浓度富氢水可显着改善体成分、血脂谱、氧化应激和炎症。这些有益的作用可能对NAFLD患者也有帮助，值得进一步研究。

这些有益的影响往往大于之前关于代谢综合征的临床研究中所报告的结果。造成这些差异的原因可能是由于那些研究中的富氢水给药持续时间较短且剂量较低。同样的原因也可能解释了我们的NAFLD研究未出现统计学上的显着变化。此外，我们无法追踪受试者的依从性，以确定使用产生富氢水的药片时的协议遵守情况。此外，富氢水给药可能改善了其他我们未检查的生物标志物（例如CD36、PPAR表达、脂联素、成纤维细胞生长因子-21、胰岛素敏感性等），这在之前的研究中已经有所改善。此外，不应期望富氢水会对已经处于正常稳态范围内的生物标志物产生显着影响。

重要的是，尽管在我们的研究中没有统计意义，但之前有报道称氢诱导增加了氧化应激标志物的水平。事实上，几项研究表明，氢气的治疗益处也与略增的MDA水平相关，即使是在安慰剂组中也是如此。 同样，我们证明氢气可以防止辐射引起的血浆TNF-α和MDA水平的升高。然而，当单独给予氢气时，TNF-α最初会升高至对照以上，然后下降并保持在低于照射组和非照射对照组的水平，而MDA往往会先降低后升高。这表明，尽管氢气主要降低MDA，但有时其治疗作用与MDA水平的暂时增加有关。同样，氢气在植物中的一些益处也是通过增加ROS的产生来实现的。此外，用氢气预处理SH-SY5Y细胞后，线粒体超氧化物产量暂时增加。随后通过诱导核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）途径上调抗氧化酶，使细胞对氢气O2诱导的氧化应激具有保护作用。Keap1-Nrf2途径的诱导在氢气的保护作用中起着重要作用。

我们的结果与提出的氢毒理学模型一致，该模型是氢气作用机制的模式基础。这也可能适用于炎症标志物和热休克蛋白的变化不一致的情况，氢气可能根据测试时间增加或减少这些变化。最近的研究表明，氢气诱导线粒体未折叠蛋白反应，这可以改善线粒体功能和细胞再生。线粒体和其他具有氧化活性的血红素辅基可能是氢气的重要靶点。因此，氢的作用可能类似于运动的激素效应，暂时增加各种细胞应激生物标志物，随后降低它们并改善细胞功能和临床参数。然而，需要额外的和/或更长期的研究来证实氢的激素效应，以确定是否会产生更有利的生物学效应。然而，需要额外的和/或更长期的研究来证实氢的激素效应，以确定是否会产生与其他氢气研究相似的更有利的生物学效应。

5.结论

总之，我们的研究增加了越来越多的文献，表明氢气具有有利的生物学效应。然而，在我们的研究中，观察到的趋势大多没有达到统计学上的显着性，即使达到了，其临床意义也不清楚。尽管如此，由于摄入富氢水既简单又安全，因此其日常使用具有实际应用价值。此外，与药物不同但与运动相似，可能需要每天和长期食用富氢水才能产生最佳的临床效果。尽管有报道称在短时间内发生了显着变化，但这对大多数人来说是不可能的，因此富氢水应作为日常习惯的辅助疗法而不是主要治疗药物。简而言之，虽然不如其他研究那样显着，但我们的初步结果与以前的研究表明，口服摄入富氢水可能对NAFLD有益，氢气可能作为温和的促激素效应剂在诱发这些生物学益处方面发挥作用，类似于运动。需要更长期的研究来确定是否涉及激素调节作用，并需要对NAFLD和NASH早期阶段的预防、维持和治疗进行进一步的研究。

免责声明：本文转载自氢思云，纳诺巴伯氢友会不对其科学性、有效性等作任何形式的保证。若内容涉及健康建议，仅供参考勿作为健康指导依据。温馨提示：氢气不是药物，不能代替药物治疗疾病。