作者/Clifford Lowell教授
4月2號，加州大學舊金山分院（UCSF）實驗室醫學系主任Clifford Lowell教授在ImmunoX Initiative 俱樂部活動做了一個講座，從病毒學、免疫學和人病理學方面對新冠做了個全面分析。
主持人：什麼是Bakar ImmunoX Initiative？這是UCSF一項大膽而一流的研究項目，企圖用社會工程、一流技術、基礎設施和獨特的數據分享模型來支持免疫科研人員和臨床醫生的工作。詳情請看: http://ImmunoX.ucsf.edu 。自從COVID-19爆發以來，很少有人從病毒學、免疫學和病理學角度對新冠進行過系統解釋。現在有請Clifford Lowell 教授。
Figure2 Lowell教授的講座幻燈片首頁
Lowell教授：謝謝主持人。本講座試圖從醫學院水平從病毒學、免疫學和病理學角度對新冠做的概要性的介紹。
先來介紹一些參考資料連結，包括新冠跟蹤系統。
第一個是霍普金斯大學的連結，跟蹤全球感染和死亡人數等等。（https://coronavirus.jhu.edu/map.html）
Figure 3 霍普金斯大學新冠跟蹤系統，數據截止4月2日
另一個不錯的跟蹤系統，可以實時跟蹤美國每個州、每個縣的數據。(https://www.statnews.com/feature/coronavirus/covid-19-tracker/?utm_campaign=cv_landing）
在講座開始之前，讓我們先來弄清些基本概念：
新冠病毒叫：SARS-CoV-2，而因感染該病毒所引起的疾病叫COVID-19，多數人兩者不分，但不應該將兩者混淆。
什麼是冠狀病毒？它是一種ssRNA（single strandRNA，即單鏈RNA）病毒，是種帶包膜(enveloped)的正鏈（plus strand）病毒，其基因組大約有3萬個鹼基對，是一種最大的RNA病毒。該病毒表面覆蓋著許多刺狀蛋白，這是該病毒最主要的能量決定因素（energetic determinants），也是與人體細胞受體結合的部分。
Figure 4 新冠病毒SARS-CoV-2
先介紹一下冠狀病毒基礎知識。自然界廣泛存在三類冠狀病毒：α，β和γ，它們主要感染禽類和哺乳動物。我們知道有4種感染人體的冠狀病毒，包括hCoV-229E、NL63、OC43和HKU-1，其中前兩者是alpha型的，後兩者是beta型的。這些病毒自1960年代之後就被發現確認，都會引起普通上呼吸道感染（URI），流行率約為15%，70%的人群被感染過，目前許多人已經帶有抗體。
近二十年出現了一些新型致病病毒，包括2002年在新加坡和多倫多等地爆發的薩斯病毒 SARS-CoV，2012年在中東等地爆發的MERS病毒，和目前正在流行的SARS-CoV-2新冠病毒。SARS和MERS都屬於beta型病毒。SARS 造成8000人感染，致死率約10%，現在已經基本滅絕，過去10年中沒有新爆發。MERDS造成2000人感染，致死率約35%，仍在中東和亞洲各地零星流行。
我們來看看新冠病毒的基因組結構。
Figure 5 SARS、CoVZC45和新冠病毒的基因組結構， Wu et al 2020 Nature
上圖第一個是正在流行的新冠病毒SARS-COV-2的基因組結構，第二個是與蝙蝠相關的冠毒的基因組結構，第三個是從多倫多分離出的SARS CoV Tor冠毒的基因組結構。它們的結構都很類似，它們的前面都有兩個主開放閱讀框（譯者註：ORF, Open Reading Frames，指基因中具有編碼蛋白潛能的序列) 。開放閱讀框ORF Ia和Ib（棕色部分），這非結構大蛋白會被裂解為16個小蛋白，這些小蛋白與病毒的複製和寄主免疫反應有關。
結構蛋白包括4種（綠色部分）：纖突蛋白（S）、病毒包膜（E）、蛋白膜（M）和病毒核酸衣殼（N）（nucleocapsid），其中，S蛋白是與人體受體結合的蛋白，與受體的血管緊張素轉換酶ACE2（Angiotensin-converting enzyme 2）進行結合。
綠色部分有幾個特殊的ORF，編號從3-9：它們在不同的冠狀病毒中不太一樣，功能可能是對先天免疫響應的蛋白進行修飾。可見，通過改變寄主的免疫響應，冠狀病毒家族可以變得非常容易進入人體細胞。
冠狀病毒是如何進入人體的呢？
從圖6可見，SARS病毒通過與受體ACE2的肽酶域（peptidase domain）結合而進入人體細胞。S蛋白和ACE2被跨膜絲氨酸蛋白酶2（TMPRSS2，見圖中綠色部分）劈開（見圖B，黃色為ACE2受體），形成一個楔口。這使得S蛋白結構發生改變（conformational change)），使得病毒的亞單位（subunit)楔入細胞膜的磷脂雙分子層（Lipid bilayer)。所以如果能夠阻斷楔入發生，則能有效阻擋S蛋白進入細胞，但如果無法阻斷楔入發生，則S蛋白便容易進入人體細胞。這個進入機制與流感很相似。
ACE2（血管緊張素轉換酶2）的表達主要在肺上皮細胞和心、腎的血管內皮上。上帝給人類ACE2酶的目的是為了降血壓。血管緊張素ACE將血管緊張素I型（Ang-I，或AT-I）劈開成為血管緊張素二型（Ang-II，或AT-II），形成較小的肽蛋白。而ACE2的功能是與ACE抗衡，可以阻止ACE產生更多的AT-II，因為過高的AT-II會導致血管收縮、肺水腫、高血管滲透性和急性呼吸窘迫綜合症等。
用ACE抑制劑可以降低ACE水平，從而降低AT-II的產生（這種方法往往被用於治療高血壓），但它只影響ACE1受體，並不影響ACE2。它可能會導致肺部病變，例如支氣管痙攣（ bronchoconstriction）
Figure6 病毒如何進入人體？
下面來看看新冠病毒與SARS-CoV的相似性和區別在哪裡：
Figure 7 新冠病毒和其他病毒的比較
上圖中，粉紅曲線是蝙蝠病毒RaTG13，與新冠病毒的相似度為96% 相同。綠色曲線是穿山甲的冠狀病毒，與新冠病毒的相似度為80%。可以看出，新冠病毒與蝙蝠冠狀病毒RaTG13的關聯最密切。
該研究目前進展迅速，有若干個機構在做，數據很新，上面的數據來自Duke大學，也就是過去兩周出來的，它比較了新冠病毒和其它幾種種相近冠狀病毒的基因組的差異。新冠病毒與蝙蝠病毒有96% 相同，主要差異有三處，即開放閱讀框ORF-1部分、S蛋白部分以及後面的ORF-8部分（這部分主管免疫響應）。這裡的關鍵是S蛋白。
新冠病毒與原初的SARS-CoV相同度只有80%相似度，但與蝙蝠病毒RaTG13有96%的相似度。RaTG13是中國在大約12年前分離出來的，它與新冠病毒的主要差異在S蛋白部分（紅色橢圓部分）。有意思的是在這個S蛋白區域，新冠病毒倒是與穿山甲病毒高度重合。可以看到，本來蝙蝠病毒的S蛋白與人體細胞膜並不結合，所以RaTG13並不能感染人體。
那麼，為什麼新冠病毒的傳染性那麼高呢？讓我們來仔細對比一下幾種冠狀病毒的S蛋白區域下的亞單元結構，特別是其中受體結合域（RBD）的差異，見圖8。
Figure 8 幾種冠狀病毒的S蛋白區域下的亞單元結構
本圖來自Scripps Research的Kristian Andersen於今年3月17號發表在《自然醫學》上的一篇論文。第一排是新冠病毒的核酸基因組排序，有將近3萬個鹼基對，其中棕色部分是S蛋白區。第二排是這個S蛋白的2個亞單元S1和S2。分析集中在受體結合域（RBD）部分 、切割區（位於S蛋白亞單元670-690之間）部分以及這個區域下的多鹼基切割點部分。該論文分析了6種冠狀病毒在這幾個區域的異同。
這6種病毒中的第一個是新冠病毒，第二個是蝙蝠病毒RaTG13，第三個是穿山甲病毒，第四個是2003年的SARS-CoV病毒，第五和第六是兩個與蝙蝠SARS-CoV相關的病毒。
如果你仔細觀察，可以發現在S蛋白區域，穿山甲的基因序列替換了蝙蝠病毒RaTG13的這段序列，形成了新冠病毒。可以假設穿山甲的基因序列與蝙蝠的基因序列在這個區域發生了重組，目前正在流行的新冠病毒就是蝙蝠病毒RaTG13獲得了穿山甲的這段S蛋白基因的結果。
與S蛋白的另一個差異位於切割區（位於S蛋白亞單元670-690之間），把S蛋白切割為S蛋白亞單元S1和S2。通過切割，可以將穿山甲的基因序列插入細胞膜。新冠的這部分鹼基來源目前尚不清楚。其中的胺基酸排列使得這個切割點特別易於接受各種蛋白酶。這段序列在蝙蝠和穿山甲的相對位置並不存在。也就是說，新冠病毒在亞單元S1和S2之間獲得了一種新型的弗林蛋白酶切割點位(novel furin cleavage site)。
我們上面提到穿山甲的S蛋白。這個穿山甲到底是什麼玩意兒？
Figure 9 食蟻獸
維基對穿山甲的定義是這樣描述的：「Pangolins, or scaly anteaters … which are used in Chinese traditional medicine for a variety of ailments including excessive anxiety and hysterical crying in children, women thought to be possessed by devils and ogres, malarial fever, and deafness」就是說，這是一種身披鱗甲的食蟻獸，傳統中醫用來治療多種疾病如：焦慮、兒童歇斯底里哭叫、婦女被妖魔纏身以及瘧疾發燒和聾啞。（不清楚為什麼不用來治療男人被妖魔纏身？哈哈！）
上面說過，新冠病毒是蝙蝠病毒和穿山甲病毒重組的結果。我們可以通過冷凍電鏡來觀察新冠病毒的S蛋白與人體受體ACE2的親和情況。
最近在《科學》雜誌上發表一篇關於新冠病毒S蛋白和ACE2受體親和性的冷凍電鏡結構，比較了新冠和SARS病毒的受體結合域（RBD）（圖10）。可見，凡是用穿山甲病毒替代蝙蝠病毒的部分，S蛋白域和ACE2域均產生了緊密結合，大大提高或促進了兩者間的親和力，所提高的級別或許是對數級的，估計親和力在納米水平上。再加上前面提到的弗林蛋白切割位點，使得新冠病毒對人群具有非常高的傳染性。這可以說是進化的奇蹟，令人不可思議。
Figure 10 新冠病毒S蛋白和ACE2受體親和性的冷凍電鏡結構
下面我們再來看看新冠病毒的複製速度：
上面提到，對新冠病毒與SARS病毒在另外兩個開放閱讀區ORF8和ORF1a為什麼有差異的原因還不清楚。我們對ORF8的功能還不完全清楚，但ORF1a可能與提高病毒複製速度有關，它可能會降低寄主自然免疫響應能力。儘管如此，我們可以知道的是，新冠病毒經過這些ORF的替換後會具有兩個特點：一是能夠容易進入寄主，二是能夠快速複製，而且要比SARS快很多。
這一點從新冠流行之初就變得十分明顯，當人們開始測試病毒核酸（RT-PCR，逆轉錄聚合酶鏈式反應） 。圖11是最近中國人發表的第一篇論文，測量新冠病人鼻拭子的RT-PCR的Ct值（ cycle threshold 循環閾值，這個值越低說明目標核酸越高）所有這些病毒在感染的初期（第一周內）的Ct值都非常低，說明核酸水平很高，但是病人並無症狀，然後病毒核酸逐漸減弱。
Figure11 新冠喉試子和鼻試子的Ct值
圖12是17年前（2003年）對SARS病毒的測試情況，可以看到SARS的複製高峰出現於感染後的第10天，此時病人才開始出現症狀。與圖11比較，新冠病毒的濃度在無症狀的早期反而較高。
Figure12 2003年14個薩斯病人鼻咽液體的RT-PCR測試
下面是一個德國慕尼黑9個病人的案例：雖然人數較少但分析的很詳盡。這些病人都是輕症，而且明確知道何時從何處被感染，他們被感染方式都是一樣的。
Figure13 拭子病毒釋放的特點
圖13是病人出現症狀後咽拭子和鼻拭子的核酸數分布情況，下半部分是病人的唾液和糞便拭子的核酸數分布情況。重要的是要了解胃上皮細胞上也會有ACE2，所以病毒很可能也會在胃上皮細胞上複製。當然，這也許是直接吞食了別的病人唾液中病毒的結果。
從圖中可見，病毒濃度在初期較高，隨著時間呈下降趨勢。本圖是以對數來表達核酸反應的Ct值的，然後再轉換為病毒濃毒值。病毒濃度大約是10^6 或10^8/mL。這個濃度其實和SARS差不多，所以新冠濃度並不比SARS高，只是比SARS來的快。
值得注意的是，在尿液和血液中並沒有發現核酸。病毒膿毒起碼得在10到6（見圖13），才能從生物樣品上分離出病毒顆粒（Virion來) 確定陽性。也就是說，只當核酸膿毒很高時，病毒才有活性。
這個案例還研究了拭子中的核酸水平與傳染性的關聯度，具體做法是測量培養組織中的病毒複製情況。無論是鼻拭子還是咽拭子，濃度最高之時就是培養組織呈陽性之時（見圖14）。此後，雖然在鼻拭子、喉拭子、唾液或糞便中仍然可以測到核酸，但培養組織中不再呈陽性，也就是說不再具有傳染性了。
Figure14 以對數表示的核算複製
圖15是9個病人的病毒濃度曲線。這個圖的繪製結合了血清轉換點的位置，我後面講抗體時再介紹。可見隨著血清轉換，病毒濃度開始減弱，但不是很快，有些人會拖很久，可能會長達22天，了解這點很重要。
Figure 15 9個病人的病毒載量、血清轉換和臨床觀察
新冠病毒的傳染性和致死率到底如何？我們來看下面這張圖。
Figure 16 各類病毒的傳染率和致死率關係
圖16中Y軸是致死率，橫軸是每個病人傳染的人數（傳染率 R0）。可見，左上角是一些致死率非常高的病毒，如禽流感和伊波拉病毒。這些病毒傳染大約1-2人，而新冠的位置大約處於致死率0.7% 到3.4%，傳染率大約1.5到3.5. 如果你和右下角的麻疹和水痘比較，它們傳播的非常快，但致死率很低。
新冠病毒的潛伏期情況如何？通過這些研究你可以大致分析新冠的潛伏期，即從被感染到出現症狀這段時間，這期間病人可能具有傳染性。從圖中可見，新冠的典型潛伏期約為5天，但也可能短到2天，長達12天。
Figure 17 新冠病毒與各種病毒潛伏期的比較
新冠在無症狀人群中的傳播：
從前面的分析可見，新冠病毒能在呼吸道上皮上快速複製，所以很容易由無症狀者傳播。它的傳染率Ro 大約為2.5，即每個感染者平均會傳給其它2.5個人。根據對一艘遊輪上新冠病毒傳播的分析來看，船上的無症狀感染者的比例約為15%。（另外，我不明白為什麼要去坐遊輪，所有的傳染科醫生都會告訴你千萬不要去遊輪。）
圖18來自Rothe在NEJM 2020年3月份發表的一篇論文：Transmission of 2019-nCoV Infection from an Asymptomatic Contact in Germany《 德國一例無症狀感染者新冠肺炎傳播研究》。
Figure18 德國零號病人接觸傳染史
上圖中，零號病人（index patient）是一位到德國參加業務會議的中國婦女。圖中列出了她的活動路線（從中國到德國）和到達德國之後的活動時間表和症狀情況：1月19號到達，22號乘坐飛機返回中國，1月22號後出現症狀，1月26號測出陽性。下面幾行列出了其它4位與這位零號病人有過接觸的活動情況和感染情況。其中病人1和2也參加了同一個會議，兩人都在1月24號出現症狀。病人1於1月27號測出陽性，病人2於1月28號測出陽性。病人1在20號和21號分別傳染給病人3和4（見橘色的C）。用這樣一種接觸史記錄方法可以讓我們計算傳播率Ro。
新冠是種經過高度進化並適應了人體的動物病毒
根據上面Rothe提供的論文分析，蝙蝠病毒有很多演化種類，許多烈性的病毒均來自蝙蝠。新冠病毒來自蝙蝠病毒，然後通過與穿山甲或其它什麼動物的病毒進行重組而得到。它獲得的S蛋白可以高效並快速楔入寄主體內，不僅與寄主的受體有高度親和力，而且還可能調節寄主的天生免疫響應。它能夠迅速大量複製，但致死率與其它病毒相比並算不太高。它相當穩定，可在腸胃道中複製並從糞便中檢測到它的分泌物。
了解這篇論文的作者最近向NEJM提交了美國國家研究院（NIH）的一個小組的一份報告，他們培養了新冠病毒並在不同物體的表面測試病毒的穩定性，以了解該病毒在不同的環境中的存活時間。它的半衰期在塑料和鋼鐵上差不多是6個小時。如果你在這些物體表面放置10的6次方個病毒粒子，幾天後你做核算檢測，病毒粒子仍在10的2次方或3次方的水平。這個案例還測試了遊輪回來22天後病毒殘留在物體表面的情況。究竟檢測到的是一種傳染性的病毒還是非傳染性的核酸是另一個問題，但可以說這個病毒非常穩定。
其結果是大自然製造了一個高度傳染性的病毒，人真不應該去干預大自然的自然選擇過程。當然所有這些論文對於病毒來源的觀點是，該病毒屬於自然進化而不是實驗室中的人工設計。有很多謠言認為這是人造的病毒, 所有將該病毒的基因組序列與其它相關病毒的基因組序列進行過研究的人都得出結論說這是一個自然進化結果。
那麼，究竟蝙蝠是怎麼回事？
蝙蝠是許多人類病原體的來源，例如SARS、MERS、伊波拉病毒、馬爾堡病毒、狂犬病、亨德拉病毒等，所有這些致命的病毒均來自蝙蝠，這到底是怎麼回事？這些病毒會進入人體並造成嚴重感染，之後又讓人體獲得免疫。可是，對人類這麼致命的病毒在蝙蝠體內為什麼只會對其造成持續的輕度感染而不會讓蝙蝠致病？
Figure19 蝙蝠病毒通過中間宿主感染人類
研究發現，蝙蝠的免疫系統是完全獨特的一種免疫系統，它們的細胞受體是多態的（Polymorphic）。蝙蝠成為許多病毒的來源是有原因的。它之所以不會被感染的真正原因是它們有著非常強大的天生免疫系統，特別是能快速產生I型干擾素響應。有些蝙蝠品種可以持續地產生干擾素並對干擾素刺激產生的基因（ISGs，An interferon-stimulated genes）產生持續表達，它們除了能夠表達α干擾素（IFNα）之外，還能夠表達多種干擾素，而且不出現感染症狀。
作為一種補償，蝙蝠的免疫系統常常降低對其它受體的先天調節能力（如NALP3功能)，擴展了NK（Natural killer）抑制受體，通過減弱對DNA的探測功能，以此來建立一個穩定病毒容忍狀態。許多人猜測，蝙蝠之所以有較高的容忍度是因為需要降低炎症反應，這樣一種持續的攜帶病毒狀態可以適應飛行時體內產生的新陳代謝壓力。
但這一切是如何演化為人體病原體的呢？請注意今年二月份伯克利大學出了篇非常棒的論文對此進行了研究（該論文是去年5月份提交的，所以與新冠無關）。他們解釋了為什麼蝙蝠病毒成了所有這些惡性病毒的來源。他們對普通非洲猴子的腎細胞系(Vero cells）和兩種蝙蝠的細胞系（其中一種會持續地產生α干擾素）進行組織培養並對其進行三種病毒感染（VSV-G，rVSV-EBOV和rVSV-MARV)），然後觀察這些病毒在三種細胞組織培養中的實時擴散情況。研究發現蝙蝠對多種病毒都有抵抗能力。
蝙蝠細胞加速病毒演化
伯克利大學的這篇論文十分優秀，它含有大量數據和數學模型（右下圖）。順便說，生物學論文一旦有大量數學，我總是會被嚇著。
Figure20 Vero細胞受到幾種病毒感染存活比例的時間序列分析
從圖中看，蝙蝠對rVSV-EBOV病毒和rVSV-MARV病毒均有抵抗性。雖然可以找到病毒殘餘，但許多細胞並未受到感染。看圖中第一行，病毒大量複製，腎細胞（Vero cells，亦稱非洲綠猴腎細胞）對病毒毫無無抵抗性，被徹底殺死，這樣病毒也就消失了。對於第三行的細胞系，因為有α干擾素的持續產生，壓制了病毒複製水平，雖然病毒仍然一直殘留在細胞組織中。
蝙蝠的強抗病毒免疫能力讓病毒在初期快速複製並產生持久的炎症。似乎蝙蝠超強的病毒免疫能力加速了病毒的變異，這雖然可以幫助蝙蝠避免炎症反應，但對人體是有害的。蝙蝠病毒的情況大致就是如此。
（此文為轉載）