2019年的諾貝爾生理醫學獎得主William G. Kaelin Jr教授曾於兩年前在《自然》發表綜述，指出當今癌症藥物靶點研究的弊端，並提出相應的解決方案，其中的一些見解也適用於生命科學其他領域的研究。
撰文 ∣ William G. Kaelin Jr
編譯 ∣ 李娟
識別藥物靶點並檢驗其有效性是抗癌藥物進入臨床前研究的關鍵。目前，有關癌症靶點的最新研究層出不窮，但良莠不齊，存在不少問題，比如結論無法被重複驗證、數據分析邏輯欠佳等。本文就癌症靶點驗證研究中普遍存在的缺點及可能的解決方法做出闡明。
必要性與充分性
隨著癌症研究數據的爆發出現，在挖掘有意義結論的過程中，區分相關性和因果關係是至關重要的。生物學中有許多例子：兩個相互關聯的事物並不存在因果關係，有時是因為二者都處於上游控制因素之下，有時二者只是偶然相關。
在描述因果關係時，有兩個詞特別有用：必要性和充分性。甲對乙是必要的，意味著如果甲不存在，乙就不可能是真的；甲對乙是充分的，意味著如果甲是真的，乙也會是真的——這對得出符合邏輯的結論是非常關鍵的。
例如，在惡性黑色素瘤中首次發現BRAF突變時，一些人認為BRAF突變不是好的藥物靶點，因為其在良性痣中也存在。但這僅表明BRAF突變不足以引起惡性黑色素瘤，臨床上我們更應看重的是BRAF的活性是否是BRAF突變黑色素瘤發展所必需的，這個問題現在已經得到肯定的回答。
此外，多重基因突變往往是癌症發生髮展的必要條件，但並不說明必須聯合使用靶向每個突變的藥物才能充分治療癌症。比如，儘管還存在其他誘發因素，但是在p53突變的腫瘤中恢復p53的功能就足以誘導癌細胞凋亡。聯合用藥的原因常是出於對耐藥性的考量。因此，研究者一定要清晰地判斷必要性和充分性，得出恰當的因果關係。
與不良預後相關的靶點判定
無法正確判斷因果，就容易曲解癌症新藥靶點的研究數據。例如，當發現某個靶點的表達與患者的不良結果相關，研究者表述結論時常暗示不良結果是該靶點引起的——這是不合理的。舉個例子，就慢性肺病患者來說，需要呼吸機的病人相比不需要呼吸機的病人來說，病情往往更嚴重、表現更差，但解釋數據時我們肯定不會認為這是呼吸機引起的。相反，需要呼吸機標示著病情發展到了更晚期的階段。
在癌症生物學中，許多分子水平的變化與癌症侵襲性的增加有關，但這些分子不一定就是導致癌症侵襲性的原因。例如，缺氧誘導因子 (HIF) 的上調錶達總是與患者的不良預後相關，這既可能意味著HIF導致某些腫瘤更具侵襲性，但也可能意味著，腫瘤生長缺乏血氧供應，才使得HIF上調。在後一種情況下，缺氧、缺氧誘導因子和不良預後之間存在因果關係，但因果關係方向與前一種推斷正好相反。再如，雌激素受體（ER) 陽性的乳腺癌患者比ER陰性的患者的預後更好，並不是因為ER抑制癌細胞生長，而是ER驅動的乳腺癌比其他亞型更具惰性。事實上，ER是最有效的癌症治療靶點之一。
總之，一個因素與不良預後相關，並不足以判斷它是否能作為癌症治療的靶點。即，與不良預後相關，並非選擇靶點的必要且充分條件。
相關性+合理性≠因果關係
那麼，兩個事物之間的因果關聯是如何確定的呢？通常是去干擾一個事物，同時測量另一個事物受到的影響。例如，當使用遺傳或化學方法破壞蛋白A的功能，導致表型B喪失，說明蛋白A的活性對於B是必需的。當激活蛋白A，總是產生表型B，說明對於B來說，A是充分的。當然，這類實驗並不能區分直接影響和間接影響，其機制將通過生化研究或結構研究得以補充。
然而，我們在文獻中常見到基於生物學上的合理性對因果關係進行推斷——「甲與乙相關，甲導致乙是合理的，因此甲導致乙。」例如，有論文做出結論說：「高水平HIF與癌症不良預後相關，很可能是高水平的HIF上調了那些促進血管生成的基因和腫瘤侵襲的基因，如血管內皮生長因子A (VEGFA) 和基質金屬蛋白酶 (MMPs) 。」但是，這個論點忽略了HIF也上調抑制蛋白合成的基因和促進自噬的基因，而這類基因又是可以抑制腫瘤的。事實上，在某些模型中HIF促進腫瘤生長，在另一些模型中則抑制腫瘤生長。
類似地，癌症靶向藥物發揮作用時，並不代表藥物一定是通過抑制其預期靶點來殺死癌細胞的。例如，在臨床前模型中，MELK（母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶）的小分子抑制劑能較好地抑制腫瘤增殖，因此進入臨床試驗，製成抑制劑藥物。然而Sheltzer等最近發現，當用CRISPR- Cas9去除細胞模型中的MELK，細胞仍然能夠存活，而且還能對至少一種MELK抑制劑保持敏感，這顯然表明該抑制劑藥物並不是通過抑制MELK殺死細胞的。可見，基於相關性和合理性來推斷因果是不恰當的。
上行表型分析更有說服力
在癌症生物學和癌症藥理學進行表型分析時，必要性和充分性的概念也非常有用。
表型分析可以分為「上行分析」 (up assays) 和「下行分析」 (down assays) 兩類。在上行分析中，人們找的是被測讀數的增加，例如酶活性的增強或細胞適應性的增強，而在下行分析中，人們找的是被測讀數的減少，例如被測蛋白水平的降低或細胞適應性的降低。
在提供生物學見解方面，上行分析通常優於下行分析，因為上行分析的信噪比更優，假陽性更少。對於給定的表型來說，必需的東西越多，該表型就越容易被損害。換句話說，降低系統性能的方法要比提高系統性能的方法更多。出於這些原因，進行高通量化學篩選和基因篩選的生物學家往往更喜歡上行分析。
然而，癌症科學家使用的表型分析幾乎總是下行分析。例如，干擾癌細胞中特定蛋白質的功能，會降低細胞的生存力、增殖力、侵襲力或致瘤性（圖1）。但我們同樣需要知道，任何降低細胞內穩性或適應性的因素都可能催生上述下行結果。
圖1 癌症生物學和癌症藥理學中常用的下行表型分析。a, 基於分析物(蛋白質或磷酸表位)水平下降的藥效學試驗。注意如果分析物的半衰期短於正常對照(通常情況下)，分析物水平的下降可能與特異性毒性藥物無關，且會導致轉錄或翻譯的整體下降。b, 細胞增殖實驗。c, 細胞活性實驗。d, 體外血管生成實驗。e, 體外細胞侵襲實驗。f, 體內腫瘤發生髮展實驗（如皮下異種移植）。g, 體內腫瘤轉移實驗（如尾靜脈注射腫瘤細胞後進行的實驗）。
那麼，癌症生物學的研究可以實現上行分析嗎？答案是肯定的。目前，很多癌症藥效學實驗是基於分析物（例如磷酸表位）的下調，那麼，找到藥物與靶點接觸時快速誘導升高的分析物，就可以成為藥效上行分析的依據。類似思路也適用於癌症生物學的化學和基因篩選實驗。如果某個信號通路在正常細胞中致癌，但在報告細胞中抑癌或降低細胞適應性，那麼就可以在報告細胞中通過上行分析來篩選抑制劑，而所用報告細胞可以是自然存在的也可以是經過分子工程改造的。
此外，癌症科學家通常使用化學物、siRNAs、shRNAs和sgRNA等來干擾癌細胞中特定靶點的功能，最終產生的表型既可能源自於干擾物對靶點的影響，也可能源自於對非靶點的影響，甚至對兩者的共同影響。在細胞分析中，當發現某一干擾物導致下行表型時，應該同時考慮是否存在破壞細胞適應性的非靶點效應。干擾物可能達到了預期的藥效學結論，並且產生了生物學合理的表型，但是這並不證明干擾物是通過結合靶點而導致該表型的——這是基於相關性和合理性推斷因果關係的又一個反例。
癌症科學家需要明確一點：要證明因果關係，需要更多的步驟。
表型拯救實驗
表型拯救實驗是證明藥靶因果關係的經典實驗。例如，甲磺酸伊馬替尼是ABL激酶活性抑制劑藥物，它通過抑制致病性BCR-ABL融合蛋白來殺死慢性髓性白血病 (CML) 細胞，而該藥物靶向作用的證實，則來自帶有BCR-ABL突變體的CML細胞產生耐藥性的證據。
製備耐藥靶點突變體的方法有數種。例如，將表達靶點的哺乳動物cDNA載體導入特定大腸桿菌中用以積累錯義突變，然後將隨機突變的表達載體庫導入對藥物敏感的哺乳動物細胞系。加藥後，篩選並擴增抗性細胞克隆，再對相應的表達載體進行測序，之後進一步測試鑑定出的突變體是否確實拮抗藥物的生化作用，或者將突變體導入幼稚細胞之後觀察能否產生抗藥表型（圖2a）。
Tarun Kapoor及同事開發了一種鑑定耐藥突變體的方法，該方法不需要事先了解相關藥物靶點。Deepak Nijhawan及同事進一步優化了該方法。在優化方法中，他們用藥物去處理充滿錯義突變、存在天然錯配修復缺陷的藥物敏感細胞，篩出抗性細胞並克隆擴增，再進行RNA-seq和全外顯子測序，以鑑定潛在的耐藥基因並加以驗證（圖2b）。如果天然存在的MMR缺陷細胞系對所研究藥物不敏感，或者其生物學特性不適合該方法，原則上可通過CRISPR-Cas9技術製備MMR缺陷細胞 (刪除一個或多個MMR基因) 。類似的，Stephen Jackson及同事也報道了利用化學誘變單倍體哺乳動物細胞來鑑定耐藥靶基因的方法。
圖2 製備耐藥突變體的方法（點擊看大圖）
在應用遺傳干擾物如siRNA、shRNA和sgRNA的實驗中，可同時導入表達靶點cDNA的載體來進行表型拯救。所用載體需不含干擾物結合位點，對干擾物不敏感。另一種逆轉靶點表型的方法是恢復靶點下游的效應子功能。例如，激活BRAF下游的MEK1，可以使BRAF突變黑色素瘤細胞對BRAF抑制劑產生抗性。在這類表型拯救實驗中，事先了解靶點下游效應子及其功能是非常重要的。
為了進一步明確功能喪失（或功能獲得）是遺傳干擾物作用於靶點所致，還可以測試相應的功能獲得（或功能喪失）實驗是否會導致相反的表型。例如，如果敲除靶點能夠抑制腫瘤生長，那麼過表達靶點則會促進腫瘤生長。但要注意一些靶點的表型效應可能與其表達水平或活性強弱沒有線性關係。
如果上述表型拯救實驗失敗，很有可能說明藥物存在非靶點效應。但是，我們需要知道，成功逆轉某些表型可能還需要滿足其他條件，比如導入的外源靶點必須達到內源靶點的丰度，並符合生理調控過程（例如細胞周期特異性調控）。解決這個問題（至少在蛋白質丰度方面）的一種方法是，將外源靶點基因置於可調控的啟動子之下，然後使用CRISPR-Cas9刪掉內源靶點表達。另一種方法是用含有靶基因順式作用調節元件的細菌人工染色體(BACs)進行拯救實驗。
在表型拯救實驗中，為了明確表型與靶點的因果關係，排除非靶點效應，有必要使用多種試劑進行檢測，比如用多個獨立的shRNAs或用化學試劑對遺傳試劑進行補充。使用不同種類的試劑得到互相佐證的實驗結果，或者通過動物模型加強細胞模型的結果，會讓癌症靶點驗證研究更具說服力。
此外，更合理地設計陽性對照和陰性對照，對解釋證明藥靶的因果關係也非常重要。
腫瘤動物模型的使用
癌症靶點研究的一大挑戰是確定臨床可耐受的最終藥物劑量，達到抑制腫瘤生長、理想情況下消退腫瘤的目的。為此，人們常用到腫瘤異種移植實驗，而這類實驗中常被忽視的一點就是用藥的時機。
在腫瘤細胞移植之前、移植時或移植後立刻應用藥物，都可能會高估藥物靶點在腫瘤維持中的作用。例如，注射到免疫缺陷小鼠體內的106個腫瘤細胞必須經過至少10次倍增才能達到1cm3的荷瘤大小，如果用藥時機過早，使細胞增殖變緩，那麼同一時間段內細胞的9次倍增就能讓荷瘤生長減少50%，而這一「好」結果其實是誇大的。
因此，理想情況下，應在已建好的荷瘤模型上使用藥物，尤其是腫瘤轉移模型。
另外需要注意的是，在免疫缺陷小鼠中引起腫瘤生長停滯的藥物，在免疫正常小鼠中，可能會使腫瘤發生消退。
預測毒性
新的癌症靶點藥物的發現常因潛在的毒性而被批評或否認，比如該靶點對維持正常胚胎髮育或成年個體的生理功能很重要等。但這種論點有不妥之處，因為：
針對癌症靶點的新藥物常常被批評或者否定，因為它可能具有潛在的毒性。比如，該靶點對維持正常胚胎髮育或成年個體的生理功能很重要，而藥物可能會導致胚胎不能正常發育，或破壞人體的生理功能……等。但這種論點有不妥之處，因為：
首先，新靶點在胚胎髮育中的功能不一定代表成年個體中的情況，而且藥物一般只是使靶蛋白功能失活，這與敲除該基因是不同的，因此將靶點的遺傳功能用於判斷化學藥靶的毒性是會誤導人的。其次，化學藥物的劑量可以控制在一定範圍，在達到治療效果的同時避免產生毒性。最後，藥物代謝存在物種差異，很多在動物模型中觀察到毒性的藥物，在人體內卻觀察不到。
結 語
未來抗癌藥物的研發依賴於藥物靶點的識別和驗證，因此相關研究的可重複性和可靠性非常重要，應當鼓勵研究者發布詳細的實驗細節、增進數據共享，這方面的原則和指南也已經出台（比如NIH Principles and Guidelines for Reporting Preclinical Research和The Reproducibility Project: Cancer Biology）。另外，學術期刊總是傾向於發表那些陽性結果或前後一致的論文，造成研究者有意無意地對研究結果進行挑選。然而，我們應該認識到，發表論文只是推進科研的手段，而不是目的。發表錯誤的或不可靠的論文既浪費了資源，也阻礙了科研進展。我們需要的是能夠經得起時間檢驗的優秀研究。儘管高標準的設定意味著更多挑戰，但只有這樣，我們才能更有效地推進抗癌研究，惠及千秋。
本文編譯自Kaelin, W. 「Common pitfalls in preclinical cancer target validation」. Nat Rev Cancer 17, 441–450 (2017) doi:10.1038/nrc.2017.32
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