我們先來看看流感病毒檢測面臨哪些挑戰？
• 病原培養是非常困難的，效率低，幾乎不可能在常規實驗室進行，臨床時效性和可行性不足。
• 流感容易發生抗原漂移，導致免疫學檢測方法效果欠佳。
• 甲型流感病毒（FluA）目前已發現18個HA亞型和11個NA亞型，需要眾多引物探針的組合才能覆蓋全部亞型。
• 流感病毒基因組高度易變，可使現有的引物探針不匹配而檢測失敗。
• 流感病毒容易發生耐藥性並存在多個潛在的耐藥位點，點突變檢測目前開展較少。
• 目前的檢測方式主要集中在定性檢測，缺乏方便準確的定量檢測方法。
理想的流感病原診斷方法具有哪些優點？
特異性強：即診斷只對流感病毒或其亞型，不同病毒/亞型之間無交叉反應。
靈敏度高：即使只有微量的目標分子，或是在很多干擾物質存在的情況下，也能有效診斷。
穩定性好：不同時間，不同地區，不同操作者規範操作時，方法性能不受影響。
簡單迅速：方法操作簡單快速，容易自動化操作，便於大規模檢測。
流感檢測時間窗口：
根據流感檢測時間窗口，我們可以看到比如PoCT、螢光檢測技術、病毒分離培養法、RT-PCR這些方法，它們檢測的時間和時間段有所不同。從這張曲線圖我們了解到，大多數方法在1-7天內病毒複製，流感病毒在感染後3-5天達到最高的病毒載量。RT-PCR的檢測時間窗口最長，可以達到14天。血清學的診斷方法也就是抗體檢測，相對來說比較滯後，大概14天後才可以用於檢測。
送檢樣本包括哪些？
由於流感是呼吸道疾病，流感病毒主要在呼吸道上皮細胞中複製，所以優先選擇呼吸道樣本進行病毒檢測，比如鼻拭子、咽拭子、鼻咽抽提物、鼻洗液、咽漱液，氣道抽提物。來自屍檢、胸腔手術、肺穿刺活檢的樣本以及BALF樣本如果能檢測到病毒通常意味著下呼吸道感染，意義重大。進行病毒分離樣本應儘量最大化收集到病毒感染的上皮細胞、鼻咽抽提物和洗液含有較多的上皮細胞，病毒分離效果較好。還有其他的檢測，比如血液、關節液，消化道樣本通常情況下很少出現病毒，送檢意義不大。禽流感重症病例高度懷疑係統性感染時可以考慮送檢。
第一類：病毒分離培養
有細胞培養和雞胚培養（9-11日齡雞胚）這兩種方法。剛才提到，病毒分離培養技術常規實驗室無法做到，只有在CDC和一些研究機構才能進行。
第二類：免疫學方法
包括膠體金快檢/免疫螢光檢測，血凝抑制實驗和中和實驗。
第三類：分子檢測方法（臨床常用）
最常見的就是PCR檢測（螢光定量PCR），還有一代測序、新一代測序技術（Next generation sequencing），都有在文獻里有一些報道。
一、病毒培養法
病毒培養一直是流感病毒鑑定的金標準，可以進行後續的抗原耐藥監測實驗。但是由於耗時費力（3-5天），並且對技術人員的要求相對來說較高，對環境要求也很高，所以在臨床診斷中無法大規模使用。
二、免疫學方法
1、膠體金抗原檢測
比較常用的是膠體金抗原檢測，現在也有些試劑的廠家在做。膠體金抗原檢測的原理很簡單，膠體金即薄膜免疫層析技術，它利用具有高度敏感性的單克隆抗體來檢測鼻咽拭子標本中的甲型和乙型流感病毒的，病毒核蛋白單克隆抗體連同一種對照抗體分別被固定到膜支持物上，形成三條獨特的線。膜支持物跟其他試劑/墊結合在一起構成檢測條。當樣本中有流感病毒時，金標抗體將與病毒結核並被Test line的第二個抗體捕獲形成肉眼可見的線，即為陽性。
這個方法速度快，10~15分鐘即可得到結果，但準確性較低，不能作為病毒陰性的診斷標準。
膠體金法不能作為流感陰性確診標準
這篇文章匯總了六種不同快速檢測方法對甲型和乙型流感的敏感性、特異性、陽性預測值（PPV）和陰性預測值（NPV）的比較。其中涉及不同廠家的品牌，這些品牌都會明確指出是針對甲流或乙流。在這些試劑盒裡面，第5個試劑僅能檢測甲型流感抗原，明確提出無法檢測乙型流感抗原。但是目前所用的大部分檢測方法都可以用於甲流和乙流。整個數據顯示，敏感性相對來說沒有特異性顯示的數據好，特異性幾乎都是100%，而敏感性最低為10%。因為第5個試劑只能檢測甲流，無法檢測乙流，所以就沒辦法統計乙流的敏感性。
總體而言，膠體金法時間短，15~30min出結果，陽性結果具有診斷意義。但是敏感度一般在40%-75%之間，在病毒載量較低時無法檢測到目標病毒，檢測陰性不能作為排除流感感染的診斷標準。膠體金方法的靶標是流感病毒NP和MP蛋白，可以確定病毒是甲型/乙型，但無法確定病毒的亞型。
2、血清抗體檢測
也有實驗室使用血清抗體檢測的方法，但是這個方法沒有被指南推薦。圖中顯示的是在病毒感染後各種抗體IgM、IgA、IgG產生的時間，我們可以看到lgM產生時間最早，大約占到血清總抗體10%，同IgA一樣可分泌到呼吸道粘膜，抵抗病毒侵入。而lgG抗體產生時間較晚，但持續時間較長，含量占到血清總抗體水平的70%。IgA是粘膜免疫的主要成員，主要分布在上呼吸道，是局部抗體，占10%左右的比例。目前，急性期和恢復期抗體水平4倍升高可作為診斷的金標準。
由於IgM的產生時間早於IgG，因此針對IgM的檢測方法理論上可以儘快發現感染。而且IgM的持續時間短，高水平的IgM更有可能是當前感染產生的（而不是先前暴露產生的）。但單次的IgM檢測仍然不能作為診斷的依據。
抗體檢測在流感診斷上存在哪些不足？
抗體一般在患者恢復期才大量產生，恢復期抗體水平4倍升高才能明確診斷，時效性差。而流感病毒抗原性高度易變，很容易發生抗體/抗原不匹配而產生假陰性。不同流感型別之間還可能存在交叉反應，影響檢測的特異性。並且，流感病毒人群感染率高，特別是季節性流感，大部分人群體內已存在較高水平的抗體，增加了結果判定的難度。如果免疫缺陷患者是流感感染的高風險人群，而這類患者的抗體產生不足，無法有效診斷。所以，目前抗體檢測的方法還沒有作為非常確證的一個依據。
三、分子診斷技術
分子診斷是指應用分子生物學方法檢測患者/病原微生物遺傳物質或表達水平的變化而做出診斷的技術。分子診斷是當前臨床病原微生物診斷技術的前沿，是肺部感染診斷技術的發展方向。
• 特異性高：檢測目標是核酸/基因，具有遺傳穩定性。
• 靈敏度高：檢測下限可達單拷貝水平。
• 適用範圍廣：適用於各種類型的樣本。
• 操作簡單：容易標準化，自動化。
分子診斷技術包括以下幾種類型
1）基於PCR的分子檢測技術：螢光定量PCR技術、數字PCR技術。
2）基因晶片技術（可以多個病原同時覆蓋）：多病原檢測。
3）DNA測序技術：Sanger一代測序、NGS技術。
4）CRISPR檢測技術：對病原的診斷和位點突變的檢測非常有前景的臨床診斷的新型技術。
先了解一下螢光定量PCR技術
現在大多數實驗室都在使用螢光定量PCR技術。一定要有螢光定量的PCR儀器，還牽扯到反轉錄的過程。每種病原採用一種顏色的探針進行標記，通過探針標記顏色區分病原。單管反應，通過檢測到的螢光信號顏色確定目標病原。由於PCR螢光通道的限制，一般PCR儀最多檢測6個通道（5種病原+1個質控）。
流感病毒亞型鑑定方法
這個方法和探針有密切關係。分別設計HA和NA的引物和探針，分別用不同顏色的螢光標記。在一管反應中可同時檢測HA和NA的亞型。
一個試劑盒的好壞要看探針所覆蓋的亞型有多少種，這就要看說明書能覆蓋多少種亞型。
模塊化檢測平台具有哪些特點？
這是列出的目前為止一些小型的模塊化檢測平台，有點像PoCT技術。GeneXpert技術是一個特別小型的機器，但它可以做很多檢測，比如結核、艱難梭菌，近期獲得國內註冊證的是流感病毒的檢測，可以同時檢測甲流和乙流，不能具體分型，但是可以知道有無流感。直接拿標本放在試劑盒裡，上機，30分鐘就可以出結果。
FilmArray在國外使用的比較多，但是在國內還未拿到註冊證。在上呼吸道感染測試中，大概覆蓋了24種病原體，其中甲流和乙流能夠做Ⅰ型和Ⅲ型。但是由於這24種病原體包括病毒和細菌，所以註冊比較困難，現在國內還沒有批准試劑盒。
這些模塊化檢測平台都是希望檢測越來越簡單、容易，不需要特別多的操作，操作相對來說方便快捷。
XpertFlu/RSV平台評估
這是中日友好醫院做的XpertFlu/RSV平台評估，發表在今年的《國際傳染病雜誌》上。這個技術可以同時檢測FluA，FluB，RSV，運行時間<30min，所以評價不錯。本團隊評估了658份樣本Xpert平台與CFDA批准的PCR檢測結果的差異，並用WHO推薦的引物探針進行第三方驗證，結果顯示Xpert的敏感性和特異性整體高於CFDA批准的單重PCR方法。
Xpert Xpress Flu/RSV平台
這個平台還可以看出Xpert報告的Ct值與樣本中病毒載量呈正相關，可以用來評估樣本中病毒載量。
總結一下流感檢測技術
下面我們來看看季節性流感IDSA指南（2018）的相關內容
什麼時候需要進行流感病毒檢測？
指南中提到住院患者必檢測，門急診患者根據流感檢測結果是否影響治療而定*
這是在指南中具體提到的流感診斷方法推薦
門診病人優先使用分子方法，而不是快速抗原診斷；
分子方法優先使用RT-PCR，提高流感檢出率；
住院病人不應使用RIDT方法；
初診病人不應使用病毒培養檢測，結果無法及時給出；
流感診斷不應使用血清學檢測。
英國衛生部（PHE）-賽沛試劑盒可作為Flu/RSV POCT技術
在歐洲，分子檢測已成為第二代快檢技術，快檢不再只是抗原快速檢測。賽沛Flu/RSV試劑盒被PHE引用作為分子POCT技術，具有更高靈敏度和特異性。
流行性感冒診療方案（2018年版修訂版）
在診療方案里，大家可以看到，臨床表現+分子診斷=確診標準；臨床表現+抗原檢測=臨床診斷，如果抗原檢測是陰性，無法排除流感。
二代測序技術的優、缺點以及應用
為什麼要採用二代測序技術？
成本低，可大批量進行流感病毒全基因組測序。無需對不同亞型病毒分別設計引物，使用通用引物即可獲得所有亞型基因組序列。可同時檢測低頻突變並評估突變型和野生型的比例。獲得病毒全基因組信息，方便後續的進化和流行病學分析。
流感病毒全基因組擴增策略
二代測序技術在流感的檢測里，可以給出全基因組擴增的信息，不需要探針，因為引物是通用的，不需要涉及特定的引物。所以新的病毒、毒種、亞型的發現，都是靠全基因組測序來確定的。
針對流感病毒基因組末端保守區，單管反應即可擴增病毒全基因組8條片段。對各種甲型流感各種亞型均適用。
流感病毒二代測序流程
二代測序對H1N1耐藥突變的動態監測
抗病毒治療前無H274Y耐藥突變。H274Y突變在抗病毒治療後第2天出現並在第7天取代野生型病毒。在第7天的時候整個突變達到了70%以上，也就是說可以檢測突變的頻率。
二代測序對H7N9耐藥位點的檢測
這也是中日醫院曹彬團隊做的一個研究。研究了二代測序技術對H7N9耐藥位點的檢測。其中有幾個病例，我們可以看到，在治療的過程中，一開始沒有突變，後來出現突變，這樣的過程需要使用二代測序技術進行追蹤。
覆蓋流感病毒所有已知的耐藥位點：R118K，E119V，D151E，R152K，I222V，R224K，H274Y，E276D，R292K，N294S，and R371K，其中R292K突變最多。
H10N8新型禽流感病毒鑑定
這篇文章是對一個新的亞型，即H10N8新型禽流感病毒鑑定。剛才提到，如果對新型的、未知的流感的亞型，一定要使用測序技術進行確定。
二代測序直接獲得病毒的全基因組序列，並獲得各關鍵位點突變信息。流感病毒序列占到非宿主序列的99%以上。
二代測序有什麼缺點？
由於所有片段共用通用引物，容易導致基因組短的片段擴增加強，長片段擴增不足，覆蓋率差異大；二代測序片段較短，無法獲得長片段上的連鎖突變（haplotype）；PCR擴增可能引入假突變；運行時間長，從文庫構建到數據產出需要36-48h，需要測序完成後數據才能下機使用。
三代測序：單分子實時測序
三代測序的基因組無需打斷，提取的核酸直接測序。可以實現測序數據實時測序實時分析。並且，單條序列長，容易組裝和後續分析。但是準確率低於二代測序。
三代納米孔測序流感病毒
我認為三代納米孔測序比較有前景。因為它可以實時讀取結果，讀到一定長度的時候就可以停止。可以直接進行RNA測序，因此樣本無需RNA反轉錄成DNA然後測序。準確率有待提高（97%~99%）。
三代納米孔結合SISPA等溫擴增檢測流感病毒
三代納米孔直接測序流感病毒RNA
三代測序 VS 二代測序
最後，總結一下二代測序與三代測序之間的差異。總體來說，二代測序讀長較短，大概在50-300bp之間，而三代測序的讀長可達8000-100,000bp。有關序列的特異性，二代測序的準確性可能會高一些，三代測序因為中間會引入一些錯誤，所以準確性要稍微差一些。從時效性來說，三代測序是對單分子進行測序，所以三代的測序技術相對來講可以實時出結果，比二代測序要快。從儀器的投入來看，都比較貴。目前測一個宏基因組大概是3000多塊的情況下，很多醫院的醫生都在送檢標本去做檢測，現在在各種論壇、ICU領域、呼吸領域中，都在談論高通量測序技術，我們也希望未來對測序技術有一個正確合理的評價。
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專家介紹
王輝
醫學博士，博士生導師，教授，研究員。現任北京大學人民醫院檢驗科主任，北京大學醫學部檢驗學系主任，國家傑出青年基金獲得者。作為亞洲唯一代表，擔任美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）藥敏折點制定工作組委員，擔任亞洲耐藥菌監測網（ANSORP）委員會常務委員、全球華人臨床和感染病學會常務理事、中華醫學會微生物學與免疫學分會常務委員、秘書長和臨床微生物學組組長、中華醫學會檢驗醫學分會委員和臨床微生物學組組長等。
本文完
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本文由呼吸界編輯 大奔 整理、排版，感謝王輝教授的審閱修改！