物質的氣、液、固態三相變化是生活中常見的現象。生命體，作為物質的一種，也不例外。2009年，科學家首次報道了細胞內生物大分子存在「液-液相分離」現象。實際上，相變在細胞中普遍存在，而相變失調可能是一些疾病的病理病因——這為科學家們審視相關疾病提供了新的視角。

撰文 | 蔣昕

人們有時候會用「單細胞生物」戲稱一個人頭腦簡單甚至缺心眼兒，其實，細胞一點也不簡單。一個細胞就像是一座由蛋白質、DNA、RNA等「磚塊」建造的城邦，這些「磚塊」搭建了不同的辦公機構，保障城邦的正常運轉。而散布在胞內的細胞器（organelle）就是這些重要的辦公場所。

其中，有一類細胞器被稱為有膜細胞器，它們在磷脂膜建造的「辦公室」里幹活兒，例如產生能量的線粒體、貯藏和轉錄DNA並產生RNA的細胞核、翻譯和加工蛋白質的內質網等。

此外，要正常發揮細胞功能，許多沒有「辦公室」的無膜細胞器也必不可少，包括細胞核內存儲核糖體RNA（rRNA）的核仁，細胞質內對各種刺激起反應的應激顆粒（stress granule）以及構成有絲分裂紡錘體的中心體等。這些細胞器沒有磷脂膜包裹，可以更動態地形成或消失。

就像室外跳廣場舞的大媽群體一樣，無膜細胞器有相對固定的隊員，大家在某個時間聚集在一起，完成活動後又自行解散。可是，蛋白質、DNA這樣的小零件是如何做到和大媽一樣聰明，自己組建「辦公區域」呢？從這個問題出發，本文將通過介紹人們對無膜細胞器形成原理的探索，引出「液-液相分離」這種組建「辦公區域」的方法，以及這種新的「建築模式」如何幫助我們了解細胞器功能和治療人類疾病。

1、流動的細胞器

相比於由磷脂膜分隔的細胞器，無膜細胞器的形成及物理性質更為撲朔迷離。我們以P顆粒為例來探究這個謎題。

P顆粒（P granule）是一種由蛋白質和RNA組成的無膜細胞器，直徑約為0.1-5 μm，它們位於秀麗隱杆線蟲生殖細胞的細胞質中。P顆粒的神奇之處在於，當線蟲的胚胎處於單細胞狀態時，它們均勻地分布在整個細胞質中，但隨著單細胞要開始分裂，P顆粒會慢慢朝細胞後側集中。有P顆粒分布的後側在分裂後將成為生殖前體細胞，而沒有P顆粒的一側則成為體細胞前體細胞（視頻1）。

視頻1. 用綠色螢光蛋白標記的P顆粒在線蟲胚胎細胞分裂過程中逐漸向細胞後側（視頻右邊）移動^[1]

那麼，沒有「外牆」的P顆粒是如何整齊地出現在細胞後側的呢？直到P顆粒發現26年後的2009年，德國馬克斯普朗克研究所的Clifford Brangwynne博士和他的導師Anthony Hyman博士偶然以一次暑期課程教學為契機，終於為這個問題交上了一份漂亮的答卷^[1]。

在生活中，延時攝影常用於觀察長時程的動態變化，這幾位科學家也採用了這一策略來觀測P顆粒的運動。他們把便於觀察的螢光蛋白連接到P顆粒里的代表蛋白質上，通過延時拍攝螢光蛋白的位置來掌握P顆粒的動態。

有趣的是，觀測結果顯示，P顆粒並不是一粒粒地慢慢朝細胞後側移動，而是先逐漸「蒸發」不見，然後再慢慢於細胞後側重新凝聚。這說明在胚胎細胞分裂的過程中，P顆粒經歷了先解散後凝聚的過程（視頻1）。

為什麼P顆粒最後都乖乖地只在細胞後側重聚呢？Brangwynne博士等人又發現，P顆粒在細胞分裂時「跑偏」的方向正好與另一種「跑偏」的蛋白質MEX-5相反。而如果讓MEX-5在細胞里均勻分布，P顆粒也就相對應地、均勻地待在細胞里了。

我們可以用水的液化來類比這個肉眼看不見的細胞內事件。假設有個箱子，內部溫度從左到右逐漸增高，我們在其中放入一個裝滿水蒸氣的瓶子，於是瓶子左邊溫度低而右邊溫度高。幾分鐘後我們將會發現在瓶子左側，水蒸氣遇冷液化成了小水珠（圖1）。而在線蟲胚胎細胞中，如果把解散的P顆粒類比為水蒸氣，MEX-5蛋白的不均勻分布就是造成水蒸氣只在單側凝結的溫度梯度。

圖1. 一個裝滿水蒸氣的瓶子放置於有著梯度溫度的盒子裡，低溫側的水蒸氣液化成水滴。（來源：作者手繪）

更有意思的是， Brangwynne博士和同事們還利用一系列精巧的實驗證明了P顆粒在細胞質中確實有如水一般的液態特徵：它們大多呈圓球形，具有表面張力並且在受壓的情況下會在細胞內流動、交融（視頻2）。

（視頻2請移步返樸微信查看2019年9月17日頭條微信文章）

視頻2. 如果用兩塊玻璃片擠壓摩擦線蟲卵細胞，就會觀察到受到剪應力（shear stress）的P顆粒在細胞質內像液滴般遊動，較小的P顆粒還會匯聚成「大水滴」^[1]

這篇2009年的論文不僅精妙地回答了胚胎細胞分裂時P顆粒的不對稱分布之謎，更揭示了無膜細胞器在細胞質中會以液態存在的現象。這個結論就像是一顆石子投入平靜的水面，激起了層層漣漪：後續的許多研究發現，除了P顆粒以外，中心體、應激顆粒、核仁等無膜細胞器也以液滴的形式存在。當然，人們還想知道，這種液滴形態是如何產生的？這種液體特性會對無膜細胞器發揮功能帶來什麼影響？

2、無膜細胞器利用「液-液相分離」召集「工作人員」，搭建「辦公區」

不知大家注意到沒有，液體形式存在的無膜細胞器其實也身處於同是液態的細胞漿（cytosol）或核液（nucleus sap）中，且互相有著清晰的界限。這種液體和液體之間互不相溶的現象並不稀罕，比如喝湯時浮在表面的香油，分層的高顏值雞尾酒等。在教科書上，這種現象被稱為 「液-液相分離」（liquid-liquid phase separation）。正是這種現象，完美地讓無膜細胞器有了相對獨立的辦公場所，能更高效地完成任務。

但無膜細胞器本身又是如何成為液態的呢？無膜細胞器中有大量蛋白質、DNA和RNA，如果單獨把這些物質拎出來，並發現它們也都能在溶液中液-液相分離，也許就能還原這些成分在細胞里凝聚成液滴的過程了。其實研究蛋白質結構的科學家早就知道，某些提純的蛋白質能在高濃度的情況下於溶液里產生液-液相分離，所以從方法上要回答這個問題不算複雜。很快，研究者們報告了一系列現象：一些無膜細胞器中的組成蛋白以及有著簡單重複序列的RNA和DNA能在細胞外形成如油滴般形態（圖2）。

圖2. P顆粒中的LAF1蛋白，核仁中的GAR-1ΔN蛋白，應激顆粒中的FUS蛋白都能在細胞外呈現液-液相分離^[2-4]

那麼，這些無膜細胞器的組成成分為什麼會「液化」呢？這是個很有實用價值的問題，因為我們一旦掌握了其中的規律，就有希望調控無膜細胞器的形成。以蛋白質為例，相比於平時如「氣體「般的彌散分布，蛋白質化為液態後，相互接觸得更多。所以，反過來說，如果能讓蛋白質連接得更緊密，就自然能促進其形成液體。

有三種情況能促使蛋白質化為液體。首先，蛋白質的量越多，越容易形成液體；其次，蛋白質本身越黏就越容易粘上更多的同伴；最後，如果蛋白本身具有疏水的特性，那就天然地不容易和水互溶了。第一和第三個特質都比較容易控制或預測，第二個特質就比較有趣了……

究竟什麼樣的蛋白是「黏噠噠」的呢？這個問題的答案仍在不停地完善中。原因可能有許多，其中最主要的是，這些蛋白上要有方便與別的蛋白「牽手」的黏性位點。舉個例子，如果組成蛋白質的胺基酸序列太單一，那這個蛋白質就很難被包裝成固定的三維結構，這樣的「百變蛋白」會像粘合劑一樣吸引其他蛋白或核酸（圖3）。不僅如此，有簡單重複序列結構的RNA也會自帶黏性，出現液-液相分離（圖4）。

圖3 . 有簡單胺基酸序列存在的蛋白不容易被包裝成固定的結構，如該蛋白兩端的結構域，像兩支靈活的手「呼朋引伴」 | 來源：維基百科

圖4. 由CUG或CAG核苷酸序列重複排列47次構成的RNA能形成液滴^[5]

除了在無膜細胞器中，液-液相分離的形式還在基因轉錄機器，mRNA剪切體甚至一些細胞組成——比如神經細胞傳遞信號的突觸區域——發揮功能。液-液相分離除了能為細胞器分隔出獨立的工作區間外，這個工作間內高度密集的「員工」也能大大提高工作效率。此外，每個分離出的小液滴也是個微型倉庫，那些暫時用不著的「貨物」可以被黏黏的蛋白拉來臨時儲存在裡面，方便調節細胞整體的工作節奏。但若不小心拉來了別人家的關鍵分子，液-液相分離也會減緩一些反應的進行。

3、像霧像雨又像……冰雹子，相變帶來的風險和機遇

既然蛋白質這些組成細胞的「磚頭」能凝結成雨一般的液珠，那是否還能凝固成「冰雹子」呢？如果你聽說過「蛋白質晶體結構解析」，應該不難回答這個問題。比如圖2中提到的FUS蛋白就能慢慢從液體變成果凍一樣的膠狀，最後成為尖牙利爪的結晶體（圖5）。這種在不同物理形態中變化的過程就是相變（phase transition）。

圖5. 純化的FUS蛋白隨著濃度的升高能從液體狀（左1）成為凝膠狀（左2），而隨著時間的增加膠狀甚至會進一步固化成晶體狀（右）^[6]

固/液形態對無膜細胞器的功能有什麼影響呢？對此，Hyman博士有一個很好玩的比喻：固態情形下的大分子就像在教室里上課的學生，在任何時間每個同學的位子都不會改變；但如果這群學生在操場上體育課，固態就變為了液態，每個時間點誰在哪裡出現都變成未知了。簡單來說，固體與液體相比少了動態，而動態是細胞生命所必須的。

而如何檢測一個無膜細胞器內的分子動態水平呢？以核仁為例，如果我們將核仁里的代表蛋白質連接上紅色螢光蛋白，再用一束高強度的雷射照射這滴紅色小球上的一點，由於光漂白作用，被照射的那一點紅色就會瞬間消失（如圖6中間圖）。但由於核仁內部有無數跑來跑去帶著紅色螢光的蛋白，所以沒有被光漂白的螢光蛋白就會移動著填補上這個空缺（圖6）。而通過計算填補所需的時間以及對比填補前後被漂白處的螢光亮度，我們就能知道這滴核仁內部的分子動態水平。

圖6 .由紅色螢光蛋白標記的核仁組成蛋白光漂白恢復的過程^[7]

隨著研究的深入，科學家們驚奇地發現，很多和疾病、特別是腦疾病相關的蛋白或RNA會發生相變。以FUS蛋白為例：FUS蛋白不僅本身能液-液相分離，還能參與應激顆粒的液-液相分離，而Fus基因的突變能造成腦脊髓側索硬化症（ALS），也就是我們熟知的漸凍症。並且，隨著漸凍症病情的發展，部分原本應是液態的應激顆粒竟有漸漸朝固態轉變的現象，而這種「變性」了的應激顆粒非常不利於細胞的存活。研究也發現，Fus基因的突變能夠加速這一變性的過程。

那是否能將這種「變性」的應激顆粒重新「融化」成液態，從而治療漸凍症呢？Hyman博士實驗室最近發表的一篇論文就朝著這個方向做出了大膽的嘗試^[8]。他們篩選出了能重新提高應激顆粒中FUS蛋白動態的小分子。他們將這種小分子試用於線蟲、果蠅和人類細胞的ALS模型中後，都觀察到了顯著的症狀改善。我們相信這個振奮人心的結果會進一步帶動更多研發工作，把相變換/相分離過程作為疾病治療的靶標。

除了這篇文章使用到的小分子藥物篩選法，如果科學家們能更深入了解液-液相分離的形成以及液-固相變發生的機制，比如找到其過程中的關鍵和限速步驟等，也將會推動我們研究疾病機制和治療方法。除此以外，相變或相分離又是如何影響細胞器或蛋白質發揮功能的？這些問題也是2009年那顆石子投下後激起的漣漪，等待著我們解答。

參考文獻

1. Brangwynne, C.P., et al., Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation. Science, 2009. 324(5935): p. 1729-32.

2. Elbaum-Garfinkle, S., et al., The disordered P granule protein LAF-1 drives phase separation into droplets with tunable viscosity and dynamics. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015. 112(23): p. 7189-94.

3. Taylor, N., et al., Biophysical characterization of organelle-based RNA/protein liquid phases using microfluidics. Soft Matter, 2016. 12(45): p. 9142-9150.

4. Monahan, Z., et al., Phosphorylation of the FUS low-complexity domain disrupts phase separation, aggregation, and toxicity. EMBO J, 2017. 36(20): p. 2951-2967.

5. Jain, A. and R.D. Vale, RNA phase transitions in repeat expansion disorders. Nature, 2017. 546(7657): p. 243-247.

6. Patel, A., et al., A Liquid-to-Solid Phase Transition of the ALS Protein FUS Accelerated by Disease Mutation. Cell, 2015. 162(5): p. 1066-77.

7. Feric, M., et al., Coexisting Liquid Phases Underlie Nucleolar Subcompartments. Cell, 2016. 165(7): p. 1686-1697.

8. Wheeler, R.J., et al, Small molecules for modulating protein driven liquid-liquid phase separation in treating neurodegenerative disease. BioRxiv, 2019, doi: https://doi.org/10.1101/721001.

延伸閱讀：iBiology上Hyman博士和Brangwynne博士的教學視頻

[1] https://www.ibiology.org/biophysics/liquid-phase-separation-in-living-cells/

[2] https://www.ibiology.org/cell-biology/cellular-organization/

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