【实验目的】初步掌握细胞原代培养的基本方法和步骤，并熟悉其原理；了解无菌操作在细胞培养中的重要性，培养严谨的科学作风。
【实验原理】体外培养的细胞直接从机体获得。大多数细胞在体外培养时能贴附在支持物表面生长，称贴附型生长细胞；少数种类的细胞在培养时不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长（如某些癌细胞和血液白细胞），称悬浮型生长细胞。本实验包括小鼠脾淋巴细胞悬浮培养与大鼠乳鼠肾脏皮质细胞贴壁培养。
【实验对象】昆明种小鼠、大白鼠乳鼠（出生3～7天）。
【实验材料】器材：CO2培养箱，超净工作台，倒置显微镜，冰箱，鼓风干燥箱，离心机，高压灭菌器，分析天平，玻璃培养皿，三角瓶，96孔细胞培养板，培养瓶，200目细胞筛，注射器针芯，移液管，吸管，量筒，pH试纸，眼科剪，镊子，棉球，酒精灯，火柴，试管架，记号笔。试剂：刀豆蛋白A（ConA），Tris碱，RPMI 1640培养液，青霉素，链霉素，小牛血清，分析纯NH4Cl，75%乙醇，0.25%胰蛋白酶溶液，Hanks液。
【实验步骤】
（一）小鼠脾淋巴细胞悬浮培养颈椎脱臼处死小鼠，75%乙醇浸泡3分钟。（以下步骤均在超净台中进行）无菌取出脾脏，用针芯研磨使细胞通过200目细胞筛而进入适量无血清RPMI 1640培养液中。1500r/min离心10分钟，弃上清，加入适量0.83% Tris-NH4Cl，室温放置5分钟，裂解红细胞后1500r/min离心10分钟，弃上清，加入无血清RPMI 1640培养液洗涤细胞2次，每次1500r/min离心10分钟，弃上清，最后加入1～2mL完全RPMI 1640培养液（含10%小牛血清，青链霉素双抗），调节细胞悬液密度为1×106/mL，接种至96孔细胞培养板。试剂加入如下：对照组：细胞悬液100µL、完全RPMI 1640培养液100µL。刺激组：细胞悬液100µL、完全RPMI 1640培养液94µL、ConA 6µL。置于37℃、5%CO2培养箱中培养42小时后，在倒置显微镜下观察，拍照比较对照组与ConA刺激组的不同。（二）大鼠乳鼠肾脏皮质细胞贴壁培养
1.取材
将乳鼠置于培养皿中，行断颈术。用75%乙醇消毒背部两次，用剪刀将背部皮肤剪除。换眼科直头小剪，在腰背部沿脊柱一侧作切口，取出肾脏置一无菌培养皿中，除去包膜及髓质，皮质用清洗液冲洗后剪碎（小于0.5mm3），再用清洗液冲洗两次，尽可能将血细胞清除干净，至清洗液清亮为止。
2.消化
将剪碎的组织块用小吸管移到盛有消化液的三角瓶中，吹打均匀，加盖塞严，置37℃温箱中消化30分钟。
3.终止消化
将消化好的细胞从温箱取出（注意不要摇动），置超净台中，用小吸管沿液面将三角瓶中的消化液吸出弃掉。加入5mL清洗液，轻轻吹打，待沉淀后，将清洗液吸除，以终止消化作用。
4.制成单细胞悬液
在终止消化后的细胞中加入10mL培养液轻轻吹打，使松散的细胞团及组织块更加松散、分离，尽可能使该培养液成为单细胞悬液，这样有利于上皮细胞贴壁生长。
5.分装培养
将细胞悬液吹打均匀后，用吸管平均分装在两个培养瓶中，每瓶5mL。用记号笔做好标记，注意识别细胞贴壁面。置于37℃、5%CO2培养箱中，每日在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，待有一定数量的细胞贴壁后即可换液。
6.换液
将培养瓶中旧培养液倒掉，随后将细胞贴壁面朝上，加入新配制的培养液，最后将培养瓶轻轻翻转，使培养液覆盖细胞面，继续进行培养。
【结果与分析】1.在倒置显微镜下可以观察到活的淋巴细胞。同时，可以观察到悬浮培养的脾淋巴细胞在ConA的刺激下快速增殖，形成淋巴母细胞克隆。2.观察细胞是否被污染，若已经污染要分析实验操作过程中可能污染细胞的步骤。3.在倒置显微镜下观察原代培养的贴壁细胞与悬浮细胞的生长有什么不同。观察贴壁的肾皮质细胞生长24、48小时后的形态及胰酶消化前后细胞形态的不同。