染色体G显带技术——万融实验

【实验目的】

掌握G显带染色体标本的制作过程；通过G显带核型分析，了解小鼠各条染色体G带的带型特征。

【实验原理】

染色体显带技术是在非显带技术的基础上发展起来的，它能显示染色体本身更细微的结构，有助于准确识别每一条染色体及诊断染色体异常疾病。

染色体显带技术是染色体标本经过一定处理，并用特定染料染色，使染色体显现明暗或深浅相间的横行带纹。通过显带技术，使各条染色体都显现出独特的带纹，这就构成了染色体的带型。每对同源染色体的带型基本相同而且稳定，不同对染色体的带型不同。

根据显带方法不同可分为Q显带、G显带、C显带、T显带等，其中G显带技术最为常用。将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其他盐溶液处理，使染色体上的蛋白质变性，再用Giemsa染液染色，普通显微镜下可观察到深浅相间的带纹，易着色的阳性带（Positive Band）为富含A-T的染色体节段，相反，G-C含量多的节段则不易着色，为阴性带（Negative Band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。

本实验采用小鼠骨髓细胞染色体标本，进行G显带及G显带核型分析。小鼠是遗传学研究常用的实验动物，其染色体数目是40条，正常小鼠的核型对肿瘤研究、杂交细胞染色体的分析，以及基因定位等工作都是必要的。

【实验对象】

昆明种小鼠。

【实验材料】

器材：光学显微镜，37℃水浴箱，普通冰箱，立式染缸，切片架，切片盒，烧杯，量筒，直头小吸管，pH试纸，吸水纸，香柏油，二甲苯，擦镜纸，镊子。

试剂：秋水仙素，生理盐水，Giemsa染液，0.25%胰蛋白酶溶液。

【实验步骤】

（一）小鼠染色体标本制备

1. 注药　取18～22g小鼠，处死前2～3小时腹腔注射秋水仙素，每10g体重注射0.04%秋水仙素0.1mL，以积累分裂相细胞。

2. 处死　脱颈椎法处死小鼠，即用左手拇指、食指固定小鼠头后部，右手捏住鼠尾，用力向后上方牵拉，使小鼠颈椎脱臼死亡。

3. 取骨髓　用剪刀剪开后肢的皮肤和肌肉，取出股骨，用一小块纱布来回搓干净附在骨上的血渍和肌肉残渣。剪掉少许股骨两端膨大的关节头（注意：两端的骨髓中含有很多的分裂相细胞，不宜剪去太多），吸取3mL低渗液于小平皿中，用剪刀尽量剪碎股骨，漂洗，然后将上清液吸入15mL离心管中。

4. 低渗　将装有低渗细胞悬液的离心管置37℃水浴20分钟。低渗处理可借渗透作用使细胞膨胀，染色体铺展，还可使黏附于染色体的核仁物质散开，使染色体分散良好。

5. 预固定　取出离心管，在细胞悬液中加入2～3滴新配制的固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1），立即用吸管吹打均匀，经1500r/min离心8分钟，吸去上清，留沉淀物。

6. 固定　加入固定液5mL于离心管，用吸管打散细胞团成均匀悬浮液，室温固定15分钟，然后以1500r/min离心8分钟，吸去上清。重复固定一次，步骤同上，离心后吸去上清，再加入1～2滴固定液。

7. 滴片　将细胞团吹打均匀，取出事先在冰水中预冷的载玻片，立即吸取细胞悬液，距载玻片大约30cm的高度滴片，滴加的悬液不能重叠，立即对准玻片吹气使细胞迅速分散。每个样品制2～3张玻片，空气中自然干燥，待晾干后染色。

（二） G显带

1消化　将配制好的0.25%胰酶溶液装入立式染色缸中并调pH值至7.0，将其放入37℃恒温水浴箱中预温。取染色体制片置胰酶缸中处理5～30秒，期间要不断地轻轻摇动，使胰酶处理均匀。

2. 漂洗　立即取出玻片放入生理盐水中冲洗两次，用滤纸吸去多余水分。

3. 染色　将标本浸入37℃预温的Giemsa染液〔1∶10的Giemsa原 液 和PBS（pH6.8）〕中染色15～20分钟。

4. 漂洗　将标本用自来水冲洗（冲洗要小 心）、晾干或用滤纸吸干。

5. 分析　显微镜下观察染色体显带效果。先在低倍镜下选择分散良好的分裂相，然后转换油镜观察其显带的情况（若染色体未出现带纹，则为显带不足，若染色体边缘发毛为显带过头，此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本）。依次找出各号染色体和性染色体，绘成草图。各染色体的位置、形状大小尽量真实（不必绘出带型），并在各染色体旁边标明染色体序号。

6. 照相　挑选出数目完全且带纹清晰的分裂相，进行显微照相、冲洗、放大，制成小鼠骨髓细胞染色体标本G显带中期分裂相照片。

【结果与分析】

1. 获得带纹清晰的小鼠骨髓细胞染色体G显带标本。

2. 在显微镜下观察染色体G显带核型，进行染色体分析。