口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)的侵袭性强，死亡率较高。虽然OSCC的诊治已取得很突出的成绩，但是中晚期患者生存质量仍然很差。为了扩展OSCC的治疗手段和提高OSCC患者的生存期，探索OSCC发病的分子机制、寻找诊断及预后的生物标志物以及治疗靶点的研究是目前亟待解决的课题。近些年，研究者发现非编码RNA在机体生长、发育及病理方面发挥了重要作用，尤其是长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)调控着恶性肿瘤的发病、转移以及复发，甚至参与了肿瘤的耐药。因此，有必要深入探讨lncRNA在OSCC发病过程中的作用机制。
作者：仇永乐1刘远航2（1河北医科大学第四医院口腔科；2石家庄市二院口腔科）
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本研究通过筛选OSCC差异表达的lncRNAs和mRNAs，建立差异表达基因共表达网络，挖掘节点基因。借助GO和KEGG通路分析，研究差异表达lncRNAs的生物学功能。通过cis和trans方法预测并分析差异表达lncRNAs可能调控的靶基因。以期探索新的OSCC高效诊断标记物，发现新的治疗靶点，为新型治疗药物和策略的研发提供依据。
方法
采用lncRNA表达谱芯片检测3例OSCC及对应正常组织的转录本，确定OSCC的lncRNAs和mRNAs差异表达谱，构建差异表达基因共表达网络，发掘网络节点基因。利用GO及KEGG富集分析，预测差异表达lncRNA的生物学功能。采用cis和trans调控，预测差异表达lncRNAs的靶基因。选取部分差异表达的lncRNAs，应用qRT-PCR验证芯片结果。
结果
1.差异表达lncRNA和mRNA数据分析实验共筛选出2294条差异表达lncRNAs（上调lncRNAs为933条，下调lncRNAs为1361条），占所有可检测lncRNAs的2.9%；1938条差异表达mRNAs（上调mRNAs为891条，下调mRNAs为1047条），占所有可检测mRNAs的10.3%。
2.共表达网络图通过构建差异表达lncRNAs和mRNAs的共表达网络，发现306个lncRNAs与其他mRNAs和lncRNAs发生着相互作用，其中TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1这两个lncRNA为发生相互作用最多的基因，是整个网络的节点基因，关系度数值分别为22、21。而其他没有发生直接作用的基因，也凭借着与相关基因的间接作用，跟这两个节点基因发生相互作用。因此，我们推测这两个基因可能是OSCC发病过程中的关键节点基因（见图1）。
图1 lncRNAs与mRNAs共表达网络图。网络每个点表示一个基因，点大小代表基因关系度数值，直线表示基因间相互作用，粉色表示mRNAs，青色表示lncRNAs，红圈表示上调，绿圈表示下调。
3.GO和KEGG通路研究GO研究结果显示，差异表达基因分别在分子功能(MF)、生物过程(BP)和细胞成分(CC)中富集。其中，富集度排名前三位的是interleukin-1 binding (GO:0019966; ontology: molecular function; P=0.0003)、response to interferon-alpha(GO:0035455; ontology: biological process; P=1.37E-10)、establishment of epithelial cell apical/basal polarity(GO:0045198; ontology: biological process; P=0.0003)。KEGG通路研究显示，差异表达的mRNAs主要富集在38个生物学途径中。其中，包括许多与癌症相关的途径，如“pathways in cancer”(富含36个差异表达基因)，“bladder cancer”(富含8个差异表达基因)，“pancreatic cancer”(富含11个差异表达基因)等。
4.靶基因预测靶基因预测结果表明，1470条差异表达的lncRNAs具有cis或trans靶基因。其中，1356条lncRNAs作用于1250条cis靶基因，370条lncRNAs作用于2454条trans靶基因，256条lncRNAs同时具有cis和trans靶基因。GO研究显示，MF靶基因主要在分子结合上富集，如“anion binding”、“ion binding”等。CC靶基因主要在细胞膜和细胞器官上富集，如“aggresome”、“organelle membrane”等。BP靶基因主要富集在合成过程，如“cellular biosynthetic process”、“organic substance biosynthetic processs”等。KEGG通路研究显示，靶基因主要富集在43条通路。其中，肿瘤通路是主要通路，但是靶基因也参与了其他通路，如“biosynthesis”、“metabolism”、“signal pathway”等等。这些富集度较高的通路，可能在lncRNAs调控OSCC发生发展过程中发挥着重要作用（见图2-5）。
图2 Cis调控下GO富集度前30位的条目
图3 Trans调控下GO富集度前30位的条目
图4 Cis调控下KEGG富集度前30位的条目
图5 Trans调控下KEGG富集度前30位的条目
5. qRT-PCR验证选取10个表达差异lncRNAs，在72例OSCC及正常组织中进行qRT-PCR验证，检验芯片结果准确性。结果显示，OSCC中lnc- MANSC4-8:1、CXCR2P1、NRIR、lnc-CMPK2-1:3和lnc-GLI3-4:1显著上调，而TMPRSS11BNL、MEG3、lnc-WRN-10:1、DANCR 和lnc-TPP2-7:2 显著下调，提示验证和芯片两者结果一致。
讨论
本实验，我们利用lncRNA芯片筛选OSCC差异表达基因，由结果获得很多差异表达lncRNAs和mRNAs，说明本实验芯片筛选效率极高。随后，为了验证lncRNA芯片结果的可信度，我们随机选择了一些差异表达的lncRNAs进行qRT-PCR验证，分析得出两者表达情况一致，说明实验筛选结果准确而可靠。研究中我们发现，下调表达的基因数量更多。说明在OSCC发展过程中，下调的lncRNAs作用更为显著。此外，通过建立差异表达lncRNAs和mRNAs的共表达网络，我们确定了两个关键节点lncRNA，分别为lncRNA TMPRSS11BNL、lnc- WRN-10:1，属于下调表达lncRNA，以前从未在OSCC或其他实体肿瘤中报道过。这两个lncRNA特异性机制及相关信号通路有待进一步研究，最终成为OSCC早期诊断、治疗及预后评估的分子标志物。
参考文献：
Qiu YL, Liu YH, Ban JD, et al. Pathway analysis of a genome-wide association study on a long non-coding RNA expression profile in oral squamous cell carcinoma[J]. Oncol Rep. 2019, 41(2):895-907.