動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是最常見的心血管系統疾病之一，其形成受多種因素影響，其中衰老導致的多種功能障礙是重要的內在發病原因。隨著人們生活水平的提高和生活習慣的改變，富含飽和脂肪酸的動物肝臟和多種高油脂食物進入人們的日常餐桌，這大大增加了低密度脂蛋白在血液中堆積的機率，加之血管韌性隨年齡的增加而普遍降低，使得動脈粥樣硬化成為我國老年人口的主要死亡原因之一。
目前越來越多的研究顯示AS的實質為血管受損後的一種慢性炎症反應，其誘導的多種細胞因子、炎症介質以及炎症細胞又進一步惡化了AS的症狀，成為惡性循環。比如血管內膜病變處招募單核細胞，單核細胞隨後進入內膜活化並分化形成巨噬細胞，在吞噬大量脂質後形成泡沫細胞（泡沫細胞是一種含有大量脂肪的巨噬細胞，是導致動脈硬化的原因之一，並可能導致心臟病和腦梗塞），成為血管硬化的基礎（Immunity, 2017）。為了攻克AS，研究人員對其發病機制已經進行深入研究，但其免疫機制在很大程度上仍未闡明。此外，該領域的大多數研究都依賴於動物模型，這些模型不能充分地再現人體的免疫環境，且缺乏自發的斑塊破裂（Thrombosis and Haemostasis, 2016）。
文章簡介
2019年10月7日，美國Icahn醫學院的Chiara Giannarelli團隊在《Nature Medicine》上刊登了題為：「Single-cell immune landscape of human atherosclerotic plaques」的文章，構建了人類動脈粥樣硬化的第一個單細胞免疫圖譜。該研究主要發現AS患者的斑塊中存在CD4+ T細胞的獨特亞群以及被激活和分化的T細胞群，且與斑塊易損性相關亞群的巨噬細胞表現出選擇性激活的表型。另外，硬化斑塊會高表達PD-1（程序性細胞死亡蛋白1）而使T細胞發生耗竭後的重編程。最後，作者提出對於患有潛在心血管疾病的癌症患者，PD-1抑制劑的使用可能增加心血管疾病風險。
研究思路
為了建立動脈粥樣硬化病變的免疫微環境圖譜，識別其血液中的組分變化並探究臨床心血管事件（clinical cardiovascular, CV）相關的細胞異質性的變化，作者結合CyTOF質譜流式細胞技術（mass cytometry）、單細胞RNA測序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）和可將蛋白質組和轉錄組數據整合的CITE-seq（cellular indexing of transcriptomes and epitopes bysequencing）技術對46名接受頸動脈內膜切除術的SYM（symptomatic：在6個月內收集到的斑塊的同側發生了腦缺血事件，即近期發病, 17例）和ASYM（asymptomatic：患者術前6個月內無缺血性事件發生，即近期未發病，29例）患者（平均年齡72.9 ± 8.7歲）的血液和斑塊樣本進行研究。
首先作者對15例患者（SYM 7例，ASYM 8例）進行CyTOF分析，發現與血液相比，斑塊中的T細胞顯示出明顯的異質性。同時，還發現SYM斑塊內T細胞適應性免疫失調。因此，作者對剩餘31名患者進行了更深入分析，首先對患者斑塊和血液中的T細胞進行了CyTOF分析，之後結合CITE-seq、scRNA-seq和細胞間相互作用分析研究了SYM和ASYM受試者的T細胞和巨噬細胞，鑑定了與CV事件相關的斑塊特異性免疫變化（圖）。
研究流程
研究結果
1 動脈粥樣硬化患者斑塊和血液的免疫表型分析
首先，為了研究免疫細胞在血液和硬化斑塊之間的差異，作者通過跨組織和患者的共有蛋白進行無偏聚類分析，發現相對於血液，硬化斑塊中CD4+和CD8+ T細胞的數量更多（～65％）。斑塊中特別富集的免疫細胞包括：巨噬細胞、CD8+效應記憶（EM）T細胞、CD4+ EM T細胞和CD4– CD8– T細胞，而血液中為：CD14+單核細胞、自然殺傷（NK）細胞、漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）、B細胞和CD4+CD8+ T細胞（圖3）。
圖3 硬化斑塊和血液中免疫細胞分布比例
2 CyTOF分析揭示了動脈粥樣硬化患者T細胞亞群的多樣性
為了進一步研究T細胞在血液和硬化斑塊之間的差異，作者對ASYM和SYM患者進行CyTOF分析，發現CD8+T細胞在斑塊中比血液中占優勢，並發現存在多種高度異質的T細胞亞群（圖4 a-d）。
圖4 血液和斑塊組織CyTOF分析中CD3+T細胞分布和亞群特徵
細胞亞群相對頻率分析發現斑塊具有較多的CD8+ T細胞和較少的CD4+ T細胞（圖4 f），證實了斑塊中富集更多的CD8+ T細胞。無偏聚類顯示斑塊分為4個亞群（圖4 d），其高表達CD69（早期激活和組織駐留標記物）（圖4 e）。其中3個是CD8 +亞群（MC10、MC11和MC20），1個是CD4+亞群（MC12）。來自MC10的CD8+ T細胞高表達CD103 ，僅在硬化斑塊中檢測到，並對應於人類淋巴組織和非淋巴組織中報道的經典組織駐留記憶（TRM）T細胞。這首次確定該細胞類型存在於人類動脈粥樣硬化動脈壁中。
作者還發現MC11、MC12和MC20亞群的T細胞相比於血液，硬化斑塊中高表達PD-1（T細胞活化的負調節劑和T細胞衰竭的標記物）（Science, 2017），這表明這些亞群可能會同時響應於斑塊慢性炎症而引發的T細胞耗竭重編程。
3 CITE-seq分析揭示動脈粥樣硬化患者T細胞與巨噬細胞在斑塊和血液中的功能差異
為了進一步解釋斑塊組織和血液中免疫分子機制和信號傳導途徑的關鍵差異，作者對斑塊和血液中的T細胞和巨噬細胞進行CITE-seq分析。與之前的CyTOF結果一致，T細胞占硬化斑塊免疫細胞的大部分，CD8+ T細胞在硬化斑塊中比血液中更富集（圖5 c）。
基因表達分析顯示斑塊T細胞表現出與T細胞活化、細胞毒性和T細胞衰竭相關的轉錄特徵（圖5 d），信號通路主要富集在炎症、細胞增殖和存活通路。相反，血液T細胞表達的基因通常會抑制T細胞功能（圖5 e）。同時作者在亞群分析中發現血液中的T細胞大多呈靜止狀態，而在斑塊中則表現出明顯的活化狀態，這表明斑塊中T細胞功能在持續性炎症反應中逐漸喪失。
圖5 血液和斑塊組織CITE-seq分析中細胞分布(a-c)和T細胞差異表達基因分析(d-e)
斑塊巨噬細胞的CITE-seq分析確定了五個不同的亞群，表明巨噬細胞也存在顯著的功能異質性。基因表達分析顯示亞群1、2和3與活化性和促炎性相關，亞群5具有泡沫細胞的轉錄特徵（圖6）。由此作者認為免疫細胞的功能失調是CV的誘因，T細胞和巨噬細胞在CV事件中扮演著重要角色。
圖6 血液和斑塊組織巨噬細胞差異表達基因分析
4 scRNA-seq分析解析SYM和ASYM患者硬化斑塊中T細胞和巨噬細胞的功能差異
為了進一步研究T細胞和巨噬細胞的功能失調和CV事件的關係，作者對SYM和ASYM患者的斑塊進行了scRNA-seq分析。作者首先分析了CD4+ T細胞，結果顯示ASYM患者的CD4+ T細胞表現出細胞活化的轉錄譜和信號傳導途徑（IFNG途徑，I型IFN信號傳導）。此外，這些細胞還特異性的上調IL-1和IL-6信號通路（IL-1充當許可信號，可穩定細胞因子轉錄本並啟用效應功能，而IL-6促進T細胞存活），而SYM斑塊中的CD4 + T細胞並沒有上調IL-1和IL-6信號傳導途徑。SYM斑塊中的CD4 + T細胞顯示出與T細胞遷移（RhoGTPase）、激活（PDGFR-β）和分化（Wnt35，IL-236）有關的獨特信號通路（圖7 a, b）。同時作者發現SYM的CD8 + T細胞中有一個亞群表現出激活IFN和T細胞衰竭信號通路的特徵（圖7 c）。由於T細胞衰竭的特徵是對慢性炎症反應的非特異性抵抗功能的逐漸衰竭（Nature Reviews Immunology, 2015），這表明這些激活的T細胞啟動了T細胞耗竭重編程。
圖7 SYM和ASYM患者斑塊中CD4+ T（a-b）、CD8+ T（c）和巨噬細胞（d）的差異表達基因分析。紅色代表SYM，藍色代表ASYM
巨噬細胞的差異基因分析顯示，與SYM巨噬細胞相比，ASYM巨噬細胞具有更高的活化性和促炎性。SYM巨噬細胞通路分析包括促血管生成的IL-8和CXCR2信號，這兩條通路涉及斑塊的不穩定性，而Hedgehog和Wnt信號涉及的抗纖維化通路則可能和斑塊不穩定性相關（圖7 d）。
綜上，作者結合單細胞蛋白質組學和轉錄組學揭示了與CV事件相關的斑塊中新的免疫失調。SYM患者中兩種T細胞譜系都呈現出與激活、分化和衰竭基本一致的基因表達特徵，而ASYM患者的斑塊中T細胞大多數被激活。
5 動脈粥樣硬化患者斑塊的細胞間相互作用
最後，為了探究ASYM和SYM患者硬化斑塊中T細胞和巨噬細胞獨特的功能狀態，作者對細胞間相互作用進行了分析。首先對T細胞與T細胞間的相互作用進行探究，發現ASYM斑塊中CD4+和CD8+ T細胞之間的配體-受體相互作用表現出促進其活化的促炎表型（圖8 a）。在SYM斑塊中，CD4+和CD8+ T細胞均表達PSEN1（可裂解斑塊中T細胞表達的Notch受體），該信號可能有助於T細胞激活、分化及PD-1表達和細胞水解功能的調控。
T細胞與巨噬細胞的相互作用表明SYM斑塊中T細胞可能通過與TLR結合的配體（VCAN）的表達激活巨噬細胞（TLR1 / 2），並導致斑塊易損性（主要由於CCL5-CCR5相互作用導致）（圖8 b）。巨噬細胞與巨噬細胞的相互作用表明ASYM斑塊中的巨噬細胞間可通過自我招募和IL-1信號傳導來誘導自我激活和促炎性相互作用，而SYM斑塊中受損的巨噬細胞表達參與細胞遷移和炎症反應的趨化因子和細胞因子（圖8 c）。
圖8 SYM和ASYM斑塊之間差異表達的配體-受體相互作用
結論與展望
該研究聯合CyTOF、CITE-seq和scRNA-seq三項技術繪製了人類首個動脈粥樣硬化斑塊的單細胞免疫圖譜，並確定了CV事件相關的特定免疫失調。同時，作者確定了斑塊T細胞類型的異質性及其對應的特化功能。與血液相比，斑塊中的T細胞活化、分化和耗竭能力增強。另外，硬化斑塊中高表達PD-1的T細胞發生耗竭，這表明PD-1抑制劑可能會激活斑塊中的這類T細胞。由於斑塊T細胞活化可能會加劇動脈粥樣硬化，PD-1抑制劑的治療可能會對患有CV疾病的患者適得其反。最後，作者還強調未來的心血管疾病監測應著重檢查免疫抑制劑對CV患者的副作用，這對改善臨床藥品的選用和心血管疾病監測具有重要意義。同時該研究也將為動脈粥樣硬化這一老年常見疾病的治療提供了新思路。
參考文獻：
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