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正文
幹細胞微環境是幹細胞賴以生存的基礎，對調控幹細胞命運具有重要的作用。
撰文：東海先生
修訂：步步先生
MSCs目前在許多臨床試驗中被應用，以研究其在免疫調節、支持造血和組織再生中的潛力。因此，開發一種快速可靠的體外擴增方法來滿足規模化的細胞劑量是必需的。
目前，微載體已被廣泛用於各種生物技術應用，已經成為幹細胞擴增和分化的一種新方法。幹細胞在微載體上的有效擴增和分化，依賴其調節細胞形狀和形成組織的能力。由於微載體的多樣性，利用特定微載體的合理設計，可能為規模化細胞製備提供均一穩定的製劑來源。
1 生物反應器一覽
生物反應器，可作為體外培養的平皿或燒瓶的替代品。簡單的攪拌容器，旋轉瓶，提供了比其他培養器皿更有吸引力的優勢，例如提供具有可擴展性和均勻性的最低濃度梯度(pH，溶解氧，代謝物)。當細胞與微載體相結合培養時，可在攪拌條件下固定並培養貼壁細胞，這無疑是最有效技術之一。在使用低血清培養基（2%的FBS）的情況下，微載體法擴增培養BMSCs是普通培養效率的8倍。
生物反應器主要類型有：攪拌懸浮式生物反應器、旋轉式生物反應器和灌注式生物反應器。
攪拌懸浮式生物反應器
目前，以旋轉瓶(SF)為原型的攪拌懸浮式生物反應器(SB)主要用於MSCs的大規模生產，攪拌臂將培養基在培養瓶中攪拌混勻。
旋轉式生物反應器
旋轉式生物反應器(RWV) 使得剪切力均勻分布，減少了3D細胞培養中的異質剪切力和湍流。該設計包括帶有氣體交換膜的圓柱室，其中容器主體繞其軸線旋轉。如果進行BMSCs擴增，可保持其分化能力。然而，也有其不足之處，其支架在尺寸上受到限制，剪切力分布不均勻，並且易發生碰撞。
灌注式生物反應器
生物反應器也可以灌注式，可連續交換介質，在排出介質的同時引入新鮮介質。灌注生物反應器由平行板、中空纖維、固定床和流化床生物反應器組成。MSCs可單層附著在填充床表面上，灌注式生物反應器為細胞生長提供了一個連續的表面積，但必須在低流速下灌注。
平行板生物反應器，可以用於大規模培養BMSCs和具有成骨潛能的祖細胞。與其類似，中空纖維生物反應器可以連續灌注模式運行，並提供低剪切力環境。其特點是，具有用於細胞培養的表面積，由一束平行的中空纖維束組成，包封在圓柱形的筒內，具有用於介質流動和圍繞纖維的氣體交換的無菌閉合迴路。中空纖維生物反應器和固定床生物反應器也存在著缺點，在可擴展性、培養監測和細胞收穫方面都存在困難。
2 3D培養的載體：微載體
說完了3D培養體系，再說一說3D培養的載體：微載體。微載體培養的ADSC和UCMSC，顯示出較低的衰老，表達了更高的生長因子，顯示出更強的遷移能力和促進癒合能力。微載體法獲得的MSCs，免疫抑制能力同樣得到增強。與2D培養相比，微載體法培養的MSCs更小，能更有效地分布到組織中。微載體法培養的MSCs，由於有一定的MSCs相互聚集，從而增強了它們的抗炎特性，而且高表達三種抗癌蛋白：IL-24、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）和CD82。
基於微載體的3D培養，微載體通常是球形的顆粒，可為細胞粘附和增殖提供更大的表面積。不同的微載體具有獨特的物理性質，如硬度和納米拓撲學，並可用各種材料製備（明膠、葡聚糖、聚苯乙烯和海藻酸鹽）。可為無孔(SoloHill塑料微載體)，大孔(CultiSpher-S)，或微孔(Cytodex-1)。
各種天然和合成聚合物材料已被用於幹細胞培養的商用微載體的骨架成分，包括葡聚糖，明膠，纖維素，聚苯乙烯，塑料，聚酯，羥基化甲基丙烯酸酯，還有聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），海藻酸鹽，和殼聚糖。微載體骨架還可以與其他化合物交聯，例如與帶陽離子的基團交聯（DEAE）或其他細胞外基質（明膠和膠原），以增強細胞粘附。
微載體的生物模量和剛度也很關鍵，但大多數微載體缺乏生物力學表征。大多數微載體，來源於原料(即葡萄糖、苯乙烯、明膠等)的交聯或聚合，具有不同程度的剛性。除了ECM外，微載體材料的化學組成和力學性能也影響MSCs的形狀和分化。
因此，不同的微載體可能具有不同的生物力學特性，用以調節幹細胞的增殖和分化。
3 微載體的粘附性
微載體與血清中的粘附分子有差異地結合。微載體影響纖維連接蛋白或層粘連蛋白（ECM的重要成分）的吸附。MSCs表達特定的整合素與ECM相互作用，可調節MSC的粘附和增殖。最適合MSCs增殖的ECM是來自骨髓基質的基質蛋白（I型膠原和III型纖維連接蛋白）、骨基質（I型膠原）、內皮基底膜（IV型膠原和層粘連蛋白），和血清（纖維連接蛋白和玻璃粘連蛋白）。
在明膠微載體(Cultispher S)上預塗了FBS，並建立了適當的補料制度，第8天達到最大細胞密度4.2×105個/mL，細胞總數增加8.4±0.8倍；而且擴增的MSCs保留了其成脂和成骨的潛能，以及克隆形成的能力。
微載體表面可以附著細胞因子，或者在細胞接種之前，將其與培養基孵育。考慮到不同來源的MSCs表達特定粘附分子的不同，微載體、表面塗層和培養基的最佳選擇取決於要擴增的MSCs的類型。
4 微載體的培養方案
利用微載體開發MSCs製備方案時，要考慮其培養條件，以便細胞在從一種微載體上到另一種微載體上。可隨時添加新鮮的微載體，以便為細胞持續擴增。相對於傳統平面培養體系，微載體培養有諸多優勢，不需要傳代培養，減少了一些操作，同時也降低了成本。
為了保證MSCs擴增所需的營養，降低代謝物水平，需要周期性更換培養基。由MSCs產生的細胞因子在擴增中也具有決定性作用。因此，雖然需要定期加入新培養基和降低不利的代謝產物，但由此也可能會去除或降低這些有益的細胞因子。工藝開發時應該考慮到。當每隔3天進行一次半量換液，再添加30%的含微載體的新鮮培養基時，BMSCs的增殖率最高。
粘附期的持續時間和攪拌方案也是在各個實驗大不相同。事實上，這一步是在靜態的條件下進行的，或低速攪拌後靜置。但也有人在細胞粘附期（24h），使用連續攪拌方案，促進了UCMSC與微載體的粘附。
純化過程包括從微載體中收穫細胞，濃縮，洗滌。微載體的選擇，僅適於最佳的細胞粘附和生長。在培養期結束後收穫細胞，同時控制最終細胞懸浮液中的微載體水平，還是很困難的。
從微載體收穫MSCs，大多都依賴於酶製劑，通常使用豬源性胰蛋白酶EDTA或TrypLEExpress/Select(Gibco)。然而，由於酶會損害細胞的表面標記物，從而可能改變細胞生物學效力，因此需要確定最佳酶濃度和孵育時間。
如果使用熱敏微載體，可以從微載體更溫和收穫MSCs。在細胞收穫後，需要去除微載體。大多數微載體比MSCs大，可以過濾分離。也可以開發可溶性微載體。由於臨床設計常常需要大量的細胞。因此，需要多次洗滌富集MSCs，以便滿足其臨床需求（MSCs輸注或注射）。
5 文末小結
MSCs的3D培養法，在培養擴增效率方面遠勝傳統的2D培養法，減少了人員操作帶來的意外風險，降低了成本，是將來細胞培養的一個方向。3D培養剛剛起步，尚需要時間的積累和驗證。
3D培養未來可期，一定會助力MSCs大規模培養的自動智能化生產。
周紅梅：臨床級幹細胞庫的建設與管理
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