長鏈非編碼RNA（lncRNA）指長度超過200個核苷酸的轉錄異質物，一般不編碼蛋白質。目前已經提出lncRNA通過充當信號傳導、引導、隔離或支架分子來影響鄰近或遠距離基因的表達。
許多研究發現一些lncRNA在計量補償效應、印記以及發育中有重要作用，然而也有一些突變實驗質疑這些lncRNA實驗結果。
這些相互矛盾的研究，引發了lncRNA對脊椎動物發育重要性的爭議。
近日，哈佛大學Mehdi Goudarzi等人在 Elife 雜誌發表題為：Individual long non-coding RNAs have no overt functions in zebrafish embryogenesis, viability and fertility 的研究論文。
該研究通過CRISPR/Cas9技術敲除斑馬魚的lncRNA，發現單個的lncRNA在胚胎髮育、生存力和生育力等方面都沒有作用，一些之前認為有功能的非編碼RNA的作用也是可有可無的。
早期胚胎髮育和成體組織的轉錄組學研究已經鑑定了斑馬魚中超過2000種lncRNA，其中727基於核糖體占據模式被確認為非編碼。
為了研究lncRNA在脊椎動物發育過程中的作用，該研究根據序列保守性、表達譜、與發育調控基因的接近度選擇了24個真正的lncRNA和1個具有非編碼功能的編碼基因。（圖1）
圖1：這25個基因，以及它們在染色體上的位置
使用CRISPR-Cas9基因編輯產生了32個敲除等位基因。24個等位基因去除了含有轉錄起始位點的區域（敲除長度為244 bp-736 bp)，8個等位基因完全或部分去除了整個基因（敲除長度為1kb-203kb)。qRT-PCR分析顯示這些lncRNA轉錄水平均有效降低（平均降低94±6％）。
以LncRNA-gas5為例，gas5是進化上保守的lncRNA，其在早期發育中高度表達，之前針對gas5的敲減或敲除實驗表明，gas5可能作為腫瘤抑制因子，並在遠距離基因組位點發揮作用。
本研究通過敲除gas5轉錄起始位點，使gas5得表達完全消失，發現gas5得臨近基因——編碼脂質結合蛋白得osbp19的表達增加了50％。但後續檢測發現胚胎髮生，生存力或生育力都沒有發現什麼變化。（圖2）
圖2：gas5的敲除實驗
其他lncRNA得敲除實驗結果也類似，觀察到一些敲除後得突變體中鄰近基因的轉錄改變，但胚胎髮生，生存力或生育力都沒觀察到變化，表明這些生理過程並不需要lncRNA參與。
但有一個例外情況，敲除lnc-phox2bb基因全長後，斑馬魚發育出現問題，且不能存活到成年。
lnc-phox2bb與phox2bb和smtnl1這兩個基因相鄰。Phox2bb是一種與交感神經系統發育有關的轉錄因子，smtnl1與平滑肌收縮有關。
lnc-phox2bb的全基因缺失導致斑馬魚頜骨變形並且不能使魚鰾膨脹，並且沒有純合突變體魚存活至成年。
轉錄起始位點缺失得lnc-phox2bb跟全長缺失一樣，都不表達mRNA，但轉錄起始位點缺失突變體正常發育並並且可育。
為了確定這種差異的原因，該研究分析了其相鄰基因的表達水平和模式，發現在lnc-phox2bb整個基因缺失突變體中沒有phox2bb的表達。因為lnc-phox2bb全長片段中含有phox2bb的增強子元件，還發現lnc-phox2bb整個基因缺失突變體中smtnl1的表達水平增加。（圖3）
這些結果表明，正常發育不需要lnc-phox2bb RNA，但是lnc-phox2bb與正確表達phox2bb和smtnl1所需的調節元件重疊。
圖3：lnc-phox2bb的敲除實驗
總的來說，該突變研究表明，這裡分析的25種lncRNA中沒有一種對胚胎髮育、活力或生育能力有重要作用，包括之前認為有重要作用的lncRNAs cyrano、gas5和lnc-setd1ba等。
但這些表型篩選不能排除更微妙的表型，例如，在行為或大腦活動中反應的表型變化。但至少說明，大多數斑馬魚lncRNA在胚胎髮育、活力或生育能力並無作用。
iNature：這項研究暗示了許多lncRNA相關研究中發現的表型變化，很可能是lncRNA表達變化引起了臨近基因表達改變導致的。因此為了研究的嚴謹性，lncRNA功能缺失實驗應使用多種不同的缺失手段，並檢測臨近基因表達變化，進行Rescue實驗等，更嚴謹地驗證lncRNA功能。
論文連結：https://elifesciences.org/articles/40815