2. 材料和方法

2.1. 試驗對象及研究設計

總共30名受試者（男性13名，女性17名，平均年齡52.9±10.6歲）診斷為NAFLD並納入本實驗，在基線和8周時接受評估。本實驗的納入標準包括脂肪變性的USG（超聲檢查）或增加的丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、γ-谷氨醯轉移酶（GMT）、超重/肥胖以及一份包含生活方式危險因素（20個問題）的問卷，同時排除其他病因引起的肝病。目前接受過治療的癌症患者、通過生物治療積極治療的類風濕性疾病患者、活動性結核病、急性呼吸道疾病或急性胃腸炎患者均被排除在外。所有NAFLD患者的整個實驗組常規使用相同藥物（抗高血壓藥物、抗糖尿病藥物、降脂藥物）而不作任何改變。研究中沒有參與者的配偶或配偶參與本研究。所有參與者均獲得書面知情同意，試驗按照《赫爾辛基宣言》進行。該研究由斯洛伐克布拉提斯拉發地區倫理審查委員會批准（NCT 05325398）。表1顯示了受試者的基線人體測量數據。

所有入選患者以雙盲方式隨機分為兩組，其中患者食用氫氣組（氫氣組；n=17）或非氫氣組（安慰劑組；n=13）（圖1）。隨機化由計算機隨機數發生器進行。該序列是通過M.S.最小化過程產生的。富氫水組的患者接受了氫生產片劑，該片劑能夠通過元素鎂和有機酸之間的水性反應用氫氣富集常規水（Drink 富氫水 and Natural Wellness Now Health Products股份有限公司，溫哥華，BC，Canada），如前所述。安慰劑組的患者接受了外觀和成分相似的片劑（即碳酸鎂、檸檬酸、碳酸氫鈉、菊粉、Kollidon 30、富馬酸硬脂酸鈉），其中產生了CO2（g）而不是氫氣（g）（Drink 富氫水 and Natural Wellness Now Health Products股份有限公司，溫哥華，不列顛哥倫比亞省，加拿大）。所有小組均被指示將一片片劑溶解在330毫升水中，等待溶解並立即飲用產生的富氫水（氫氣>4mg/L），每天三次，持續兩個月。在實驗開始和結束的前一天晚上禁食後，在早晨（上午8點之前）將血漿收集在檸檬酸鈉溶液中。收集的血液通過離心分離（在4°C下以3000×g的速度離心10分鐘），並立即儲存在-80°C下，直至分析。

Figure 1 CONSORT flow diagram.

2.2. 臨床生化/血液學參數

所有生化/血液學參數（白蛋白、鹼性磷酸酶、丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、C-反應蛋白、總膽固醇、高密度脂蛋白、甘油三酯）均由SYNLAB，布拉迪斯拉發進行測量。使用貝克曼庫爾特公司的化學分析儀AU5812（美國加利福尼亞州布雷亞市）評估生化參數，ALT和AST採用國際臨床化學聯合會（IFCC）方法，鹼性磷酸酶採用比色法，白蛋白採用BCG法。對於血脂參數（膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯），使用酶促CHOD-PAP和比色測試。CRP的測定採用免疫比濁法。

2.3. 氧化應激標誌物

2.3.1. 丙二醛測量

丙二醛（MDA）分析使用TBARS試劑盒（產品編號700870，密西根州安阿伯市的Cayman化學品公司）按照製造商的說明進行。簡要地說，將100μL血漿與由乙酸、氫氧化鈉和硫代巴比妥酸組成的彩色試劑溶液混合。將該混合物煮沸1小時，然後立即放在冰上10分鐘。在4°C下以1600×g離心10分鐘後，測量反應產物（MDA）在530nm處的吸光度（Synergy H1微量板讀數器，加州聖克拉拉市的Biotek公司）。使用丙二醛作為標準品。

2.3.2. 8-羥基脫氧鳥苷測量

8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法使用8-OHdG ELISA試劑盒（Elabscience，德克薩斯州休斯頓市；E-EL-0028）按照製造商的說明進行測量。簡要地說，將50μL血漿與特異性針對8-OHdG的生物素標記檢測抗體工作液混合，並在37°C下孵育45分鐘。將溶液從孔中取出並洗滌三次。用相同的程序進行辣根過氧化物酶（HRP）偶聯工作液和底物反應液（分別在37°C下孵育30分鐘和15分鐘）的處理。通過添加50μL終止液終止反應。在450nm處測量平板（Synergy H1微量板讀數器，加州聖克拉拉市的Biotek公司）。

2.4. 乳酸脫氫酶測定

乳酸脫氫酶（LDH）活性分析使用乳酸脫氫酶活性測定試劑盒（密蘇里州聖路易斯市的Sigma-Aldrich公司）按照製造商的建議進行。將2μL血漿與48μL LDH測定緩衝液和主反應混合液（由48μL LDH測定緩衝液和2μL LDH底物混合液組成）混合。使用標準NADH。將這種溶液和樣品混合，在37°C下每2-3分鐘測量一次450nm的光密度（Synergy H1微量板讀數器，加州聖克拉拉市的Biotek公司），直到最活躍樣品的值大於最高標準值為止。

2.5. 蛋白質印跡

蛋白質分析根據我們之前的研究（Kura等人，2019年）進行。用Laemmli緩衝液處理的血漿樣本被應用於12.5% SDS-PAGE聚丙烯醯胺凝膠，通過電泳分離（120V），並轉移到硝酸纖維素膜上。轉移後的蛋白質通過Ponceau S溶液（密蘇里州聖路易斯市的Sigma公司）可視化。膜印跡用TBS（1M Tris，5 M NaCl在水中，pH 7.4，吐溫-20）洗滌，用5% BSA在TBS中封閉4小時，並與適當的一抗在補充表S1中指定的稀釋度下孵育。然後將膜洗滌並用山羊抗山羊IgG、抗小鼠或山羊抗兔IgG與HRP結合的物質孵育1小時。再次用TBS溶液洗滌膜，然後施加發光團（發色團）、香豆酸和過氧化氫以引發化學發光反應。化學發光反應在Amersham Imager 600儀器（瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB，丹麥達爾馬丁）中檢測。從蛋白質印跡獲得的所有數據都使用ImageJ軟體版本1.8.0_172計算。

2.6. 明膠凝膠電泳測定基質金屬蛋白酶活性

基質金屬蛋白酶（MMPs）-2和MMP-9的活性通過在含有2 mg/mL明膠的10%聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳來評估。將稀釋後的血漿樣本在不含2-巰基乙醇的Laemmli緩衝液中製備，加載到凝膠中而不進行變性。電泳後，用50 mM Tris-HCl（pH 7.4），含有2.5% Triton X-100洗滌凝膠，然後在37°C下在含有50 mM Tris-HCl、10 mM CaCl2和1.25% Triton X-100的底物緩衝液中孵育過夜。孵育後，用1% Coomassie Brilliant Blue G-250染色凝膠，然後用40%甲醇和10%乙酸洗滌。透明帶表示MMP-2和MMP-9的膠原水解活性，背景為深藍色。

2.7. 統計分析

根據可用性、意願和統計上所需的最小樣本量確定受試者招募的樣本量。統計分析由JM使用R統計軟體環境（www.r-project.org，訪問日期：2021年7月11日）進行。所有顯著性水平設置為α = 0.05。使用Shapiro–Wilk測試檢驗數據的正態性。如果測試拒絕正態性，則應用Mann–Whitney測試；否則，使用兩個樣本t檢驗。

3.試驗結果

3.1. 受試者 本研究採用隨機雙盲安慰劑對照的方式進行。所有入選患者（13名男性和17名女性）來自斯洛伐克共和國的布拉迪斯拉發地區。安慰劑組的平均年齡為53.23歲（±9.13歲），氫氣組的平均年齡為52.65歲（±11.9歲）。幾乎所有患者都患有肥胖症，體重指數（BMI）的平均值在安慰劑組為32.8（±3.37），在氫氣組為35.52（±4.03）。所有參與研究的患者均未出現不良反應並完成了試驗。兩組患者的血壓水平均處於正常範圍內。 在為期兩個月的富氫水攝入後，幾乎所有測量到的患者基本特徵指標呈積極趨勢：體重（減少）、BMI（減少）、收縮壓（降低）。然而，這些測量結果並未顯示出統計學意義（p>0.05）（表2）。

3.2. 富氫水攝入改善血漿生物標誌物 我們使用臨床生化/血液學實驗室的標準生物醫學和血液學方法測量了指示脂質水平和肝功能以及血液分析的生化參數。對於每個組別，我們將個體生物標誌物的基線值與其在8周隨訪後的數值進行比較（表3）。 在兩個組別中，天門冬氨酸轉氨酶（AST）和丙氨酸轉氨酶（ALT）的非顯著性下降幅度相似（p>0.05）。另一方面，兩組的C反應蛋白（CRP）、白蛋白（ALB）、鹼性磷酸酶（ALP）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和甘油三酯/高密度脂蛋白比率（TG/HDL）均有輕度增加（p>0.05）。除了CRP、TG、LDL和TG/HDL比率外，這些非顯著性增加在富氫水組最為明顯，而安慰劑組的增加更為顯著（p>0.05）。相比之下，乳酸脫氫酶（LDH）水平在安慰劑組傾向於增加（2.63%），在富氫水組傾向於減少（5.98%）（p>0.05）。

3.3. 氧化還原狀態生物標誌物 如表3所示，MDA水平在安慰劑組傾向於降低，但在富氫水組傾向於增加，兩組之間的差異達到統計學意義（p<0.05）。然而，富氫水組的後-MDA水平與安慰劑組的基線水平相當，分別為3.13±1.60和3.11±1.53。兩組的8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）均有非顯著性增加，但富氫水組的增加趨勢更為明顯。我們還監測了銅/鋅超氧化物歧化酶（SOD1）的水平。如圖2所示，安慰劑組的SOD1水平增加了約20±16.71%，而富氫水組的SOD1水平保持不變（增加約0.04±22.61%）。兩組之間的差異達到統計學意義（p<0.05）。

圖2 從基線到隨訪的相對百分比變化：SOD1。n=13（安慰劑組），n=17（氫氣組），*p<0.05。

3.4. 炎症標誌物和熱休克蛋白 如圖3所示，炎症標誌物腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在兩組中從基線到隨訪時均無顯著變化（安慰劑組98.20±16.55%；富氫水組99.34±21.71%）。然而，核因子κB（NF-κB）在安慰劑組有非顯著性增加趨勢（101.23±12.62%），在富氫水組有非顯著性下降趨勢（99.41±15.15%）。類似地，熱休克蛋白-60（HSP60）和HSP70在兩組中均未發生變化。然而，HSP70在安慰劑組輕微增加（104.60±14.24%），在富氫水組輕微減少（99.90±19.14%），而HSP60在兩組中均有增加趨勢（安慰劑組101.92±18.06%；富氫水組102.37±16.02%）。

圖3 炎症標誌物（a）和熱休克蛋白水平（b）。HSP60 = 熱休克蛋白60；HSP70 = 熱休克蛋白70；TNF-α = 腫瘤壞死因子α；NF-κB = 核因子κB。n=13（安慰劑組），n=17（氫氣組），p<0.05。

3.5. 基質金屬蛋白酶 我們發現血漿中的基質金屬蛋白酶（MMPs），MMP2在安慰劑組和非顯著性下降趨勢（96.15±7.14%），在富氫水組也呈非顯著性下降趨勢（95.07±10.09%）。此外，MMP9在安慰劑組有增加趨勢（103.67±8.89%），在富氫水組有下降趨勢（97.12±8.36%），但差異仍不具有統計學意義（圖4）。

圖4 富氫水對基質金屬蛋白酶的影響。MMP = 基質金屬蛋白酶。n=13（安慰劑組），n=17（氫氣組），p<0.05。

4.討論

在這項隨機、雙盲、安慰劑對照的研究中，我們調查了高劑量氫水（即>12mg/天）對NAFLD患者8周的影響。由非顯著改變的肝酶提示，氫水干預無不良事件。此外，研究對象對每天三次頻繁消耗氫水有良好的耐受性。

在這項為期8周的研究中，安慰劑組有體重增加的趨勢(≈0.23公斤)，相反，氫水組出現了體重下降的趨勢，平均體重減少了≈1公斤。雖然體重的變化沒有統計學意義，但與安慰劑組相比，氫水組的BMI有統計學意義上的顯著降低。這些體重和BMI的改善可能具有臨床意義，特別是考慮到我們研究的短期持續時間。這些結果與我們之前的研究結果一致，即代謝綜合徵患者使用高濃度氫水24周後，體重和BMI顯著降低。

在氫水組中，我們發現收縮壓下降的趨勢(≈2mmHg)，但沒有達到統計學意義。這可能是由於研究的短期持續時間和對象的血壓相對正常。例如，舒張壓低於80mmHg，收縮壓處於高血壓前期標準的低值。儘管2mmHg的收縮壓下降沒有統計學意義，但它可能具有臨床意義。事實上，一項薈萃分析發現，休息時收縮壓降低2mmHg可使冠心病死亡率降低4%，中風降低6%，所有原因所致死亡降低3%。

我們還觀察了氫水對肝功能和膽固醇的各種生物標誌物的影響，並觀察到這些領域的益處。然而，與其他研究相比，這些參數的變化沒有達到統計學意義。需要進一步的研究來證實這些觀察結果並確定潛在的機制。

我們還研究了富氫水對肝功能和膽固醇的各種生物標誌物的影響，並觀察到這些領域的有益趨勢。然而，與其他研究相比，這些參數的變化仍然不明顯，這可能是由於以下原因：（i）這些值已經處於穩態/範圍內，或（ii）研究持續時間較短。我們之前對代謝綜合徵患者進行的為期六個月的調查顯示，許多這些參數都有所改善，這與其他的臨床報告相符。例如，與安慰劑組相比，富氫水具有增加HDL膽固醇的重要趨勢。此外，富氫水減輕了兩個月內TG水平的上升。這些對TG和HDL的影響導致富氫水組與安慰劑組相比，TG/HDL比值明顯更高（即分別為3.64和4.25）。也就是說，安慰劑組增加了11.2%，而富氫水組僅增加了0.55%。TG/HDL比值越高，冠狀動脈疾病的風險就越大，這也是全因死亡率的獨立預測因素。儘管有這些有利趨勢，但與以前的研究相比，絕對變化並不大，因為以前的研究中基線膽固醇水平明顯升高。在我們的研究中，總膽固醇仍低於200mg/dL，對於年齡相似的受試者，大型前瞻性隊列研究表明TC水平低於200mg/dL與死亡率增加有關。由於膽固醇水平和健康可能遵循反向U形曲線關聯，因此測試富氫水給藥對膽固醇水平較高（如>250mg/dL）人群的影響將是有趣的。

據報道，氫氣在細胞、動物和人體臨床研究中具有抗氧化作用[4]。與基線相比，安慰劑組SOD1水平略有增加，富氫水組保持不變。有趣的是，我們觀察到富氫水組MDA（≈17.2%）和8-OHdG（≈8.3%）略有增加，但差異無統計學意義，而這兩種物質是氧化應激的標誌物。這些增加遠小於劇烈運動後誘發的增加。例如，在受過訓練的男性跑步者中，進行一次自適應的21公里跑，強度為最大攝氧量的77%，之後MDA增加了約11.5%，而進行60分鐘類似的強度運動後，尿8-OHdG增加了約276%。這些數值應與慢性疾病和病理條件下經常報告的百分之幾百的增加進行比較。此外，與運動或氫氣不同，在疾病狀態下，氧化應激持續升高，導致抗氧化劑消耗和細胞損傷。我們發現，服用富氫水後，LDH水平降低了約6%，這可能表明其具有保護作用，正如先前所證明的那樣。

除了已知的抗氧化作用外，氫氣還被證明具有選擇性抗炎作用。然而，與之前的研究相反，我們的結果表明TNF-α沒有變化，只有富氫水略微降低NF-κB的趨勢。熱休克蛋白（HSP）可以被炎症上調；因此，我們觀察到HSP60或HSP70沒有變化。然而，HSP70與NF-κB水平有相似的趨勢，即它們在安慰劑組中趨於增加，在富氫水組中趨於減少。同時，我們發現由炎症調節的MMP-2和MMP-9也沒有明顯變化。然而，MMP-9在安慰劑組中有適度增加的趨勢，在富氫水組中有適度減少的趨勢。這與之前的研究結果一致，表明富氫水通過抑制MMP-9和MMP-2有效地減少了平滑肌細胞的遷移。MMPs的血清表達與肝損傷標誌物的血清水平相關，在兩組中均沒有顯著變化。這增加了富氫水對MMPs無效作用的可能性，這可能是由於與MMPs被更大刺激顯著上調的研究相比，NAFLD受試者中富氫水的表達較低。

富氫水已顯示出緩解許多疾病病理學的希望，包括COVID-19，由於其抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。在飲食誘導NAFLD的動物模型中，富氫水有效地改善了體成分並減少了肝臟中的脂質積累。這些益處至少部分通過富氫水誘導的乙醯輔酶A氧化酶、脂聯素水平的上調，CD36表達的減少以及炎症標誌物TNF-α和IL-6的表達減少來實現。這與表明富氫水在動物模型NAFLD中的有益作用的其他研究一致。此外，對12名NAFLD患者進行的為期28天的雙盲、安慰劑對照交叉試驗表明，富氫水顯著減少了由雙回波MRI評估的肝臟脂肪積累。然而，與我們的研究類似，沒有發現代謝譜的統計學顯著變化。

我們之前在60名代謝綜合徵患者的雙盲、安慰劑對照研究中證明，連續六個月給予高濃度富氫水可顯著改善體成分、血脂譜、氧化應激和炎症。這些有益的作用可能對NAFLD患者也有幫助，值得進一步研究。

這些有益的影響往往大於之前關於代謝綜合徵的臨床研究中所報告的結果。造成這些差異的原因可能是由於那些研究中的富氫水給藥持續時間較短且劑量較低。同樣的原因也可能解釋了我們的NAFLD研究未出現統計學上的顯著變化。此外，我們無法追蹤受試者的依從性，以確定使用產生富氫水的藥片時的協議遵守情況。此外，富氫水給藥可能改善了其他我們未檢查的生物標誌物（例如CD36、PPAR表達、脂聯素、成纖維細胞生長因子-21、胰島素敏感性等），這在之前的研究中已經有所改善。此外，不應期望富氫水會對已經處於正常穩態範圍內的生物標誌物產生顯著影響。

重要的是，儘管在我們的研究中沒有統計意義，但之前有報道稱氫誘導增加了氧化應激標誌物的水平。事實上，幾項研究表明，氫氣的治療益處也與略增的MDA水平相關，即使是在安慰劑組中也是如此。 同樣，我們證明氫氣可以防止輻射引起的血漿TNF-α和MDA水平的升高。然而，當單獨給予氫氣時，TNF-α最初會升高至對照以上，然後下降並保持在低於照射組和非照射對照組的水平，而MDA往往會先降低後升高。這表明，儘管氫氣主要降低MDA，但有時其治療作用與MDA水平的暫時增加有關。同樣，氫氣在植物中的一些益處也是通過增加ROS的產生來實現的。此外，用氫氣預處理SH-SY5Y細胞後，線粒體超氧化物產量暫時增加。隨後通過誘導核因子紅細胞2相關因子2（Nrf2）途徑上調抗氧化酶，使細胞對氫氣O2誘導的氧化應激具有保護作用。Keap1-Nrf2途徑的誘導在氫氣的保護作用中起著重要作用。

我們的結果與提出的氫毒理學模型一致，該模型是氫氣作用機制的模式基礎。這也可能適用於炎症標誌物和熱休克蛋白的變化不一致的情況，氫氣可能根據測試時間增加或減少這些變化。最近的研究表明，氫氣誘導線粒體未摺疊蛋白反應，這可以改善線粒體功能和細胞再生。線粒體和其他具有氧化活性的血紅素輔基可能是氫氣的重要靶點。因此，氫的作用可能類似於運動的激素效應，暫時增加各種細胞應激生物標誌物，隨後降低它們並改善細胞功能和臨床參數。然而，需要額外的和/或更長期的研究來證實氫的激素效應，以確定是否會產生更有利的生物學效應。然而，需要額外的和/或更長期的研究來證實氫的激素效應，以確定是否會產生與其他氫氣研究相似的更有利的生物學效應。

5.結論

總之，我們的研究增加了越來越多的文獻，表明氫氣具有有利的生物學效應。然而，在我們的研究中，觀察到的趨勢大多沒有達到統計學上的顯著性，即使達到了，其臨床意義也不清楚。儘管如此，由於攝入富氫水既簡單又安全，因此其日常使用具有實際應用價值。此外，與藥物不同但與運動相似，可能需要每天和長期食用富氫水才能產生最佳的臨床效果。儘管有報道稱在短時間內發生了顯著變化，但這對大多數人來說是不可能的，因此富氫水應作為日常習慣的輔助療法而不是主要治療藥物。簡而言之，雖然不如其他研究那樣顯著，但我們的初步結果與以前的研究表明，口服攝入富氫水可能對NAFLD有益，氫氣可能作為溫和的促激素效應劑在誘發這些生物學益處方面發揮作用，類似於運動。需要更長期的研究來確定是否涉及激素調節作用，並需要對NAFLD和NASH早期階段的預防、維持和治療進行進一步的研究。

免責聲明：本文轉載自氫思雲，納諾巴伯氫友會不對其科學性、有效性等作任何形式的保證。若內容涉及健康建議，僅供參考勿作為健康指導依據。溫馨提示：氫氣不是藥物，不能代替藥物治療疾病。