隨著美容護膚品市場的不斷發展，新的化妝品和美容護膚手段層出不窮，化妝品不良反應及化妝品皮膚病的發生幾率也逐年增加。國家成立了專門的監督管理機構和診斷機構對化妝品不良反應進行監測，並同時加強對新研發化妝品上市前安全性的評估。對一種化妝品的安全性評估主要評價其是否具有使皮膚致敏和引起過敏性接觸性皮炎的可能性。目前評價的方法包括對產品組分結構特性的分析、文獻回顧、動物局部淋巴結試驗（LLNA）和人體試驗等。其中，人重複性損傷性斑貼試驗（Human Repeated Insult Patch Test， HRIPT）被認為是證明產品不會在人體產生不良反應的*可信方法[1]，用於對動物實驗中已經判定為無明顯不良反應水平（NOEL）的物質的確證試驗[2]。目前國內很少有報道採用HRIPT進行化妝品安全性評估。本文介紹了筆者科室近期進行的一項針對常見刺激物及11種受試產品的HRIPT試驗，對如何進行HRIPT試驗和結果判讀進行闡述。
什麼是HRIPT/RIPT?
重複結果斑貼試驗是目前最嚴格的研究。使用產品或原材料後不會有潛在的刺激或過敏。使用九組誘導貼片，然後在休息一段時間後進行一組刺激試驗。
Hript：人體反覆損傷斑貼試驗（Hript）
測試分為誘導期和刺激期。通過多次重複測試，我們最終可以判斷受試者是否有紅斑或其他不良刺激反應，測試通過後會被亞馬遜審核通過。
化妝品在使用時與人體表面直接接觸，如果產品存在問題，可能會引起包括皮膚不良反應。斑貼試驗作為常用的化妝品安全性測試，可以檢測這種潛在可能性，以確保化妝品使用安全性。
2.HRIPT/RIPT測試過程：
步驟1
樣品到達實驗室後，將給受試物一個獨立的實驗室測試編號，並記錄批號、樣品規格、贊助商、接收日期和測試請求，並通過測試日誌進行驗證。
步驟2
志願者篩選：根據研發人員的意見，檢測人員需無全身疾病或皮膚病病史，否則會影響檢測結果或增加不良反應風險。如果皮膚顏色適合觀察紅斑試驗，任何皮膚性質和任何種族都可以參加，最後選擇53人的研究樣本。
步驟3
測試分為誘導期和刺激期。通過多次重複測試，我們最終可以判斷受試者是否有紅斑或其他不良刺激反應。
1 材料和方法
1.1實驗對象：53名健康自願受試者，其中男性6名，女性47名。受試者年齡為23～53歲（平均為34.7歲）。排除標準：處於懷孕期、哺乳期或分娩半年內；患有可能干擾試驗結果或增加受試者研究參加風險的急性或慢性疾病；正在口服或外用可能干擾試驗結果的藥物（如糖皮質激素、非甾體類消炎藥、抗組胺類藥物和免疫抑制劑等）；患有慢性過敏性皮膚病或近12個月內被診斷為皮膚腫瘤並接受治療者；在斑貼部位有日曬傷、皮膚顏色不均勻、文身、痤瘡、濕疹、牛皮癬、瘢痕及其他可能會影響觀察的皮膚病受試者；試驗經過北京大學第一醫院倫理委員會批准，所有受試者知情同意並簽署知情同意書。
1.2試驗材料
1.2.2斑試器：封閉式斑試器：為貼附於封閉式膠帶上的8mm鋁製小碟（北京大學醫學部醫學儀器公司）；半封閉斑試器：為直徑23mm的圓形防過敏膠帶（Curad Sensitive Skin ， Beiersdorf Inc.， Wilton CT）。
1.3試驗流程[3]： 整個試驗過程分為誘導期（3周），休息期（2周）和激發期（1周）三部分，持續時間為6周。試驗過程如圖1所示。
1.3.1誘導期：將加有受試物的斑試器用無刺激膠帶貼敷於受試者的脊柱右側，用手掌輕壓以使之均勻地貼敷於皮膚上，並用標記筆標記斑貼部位，保證誘導階段9次每個產品都是貼在相同的部位（每周一、三、五進行），如圖2所示。持續24h後，囑受試者將斑試器取下，避免搓洗局部。再間隔24h後（即下次斑貼之前，周五斑貼的為間隔48h）觀察反應。以上步驟共重複9次，持續時間為3周。
1.3.2 休息期：在誘導期結束後休息10～14天，期間無任何處理。
2 結果
2.1結果判讀：HRIPT的結果是根據受試者在誘導期和激發期的皮膚反應綜合判定的。如受試者在某個樣品點上誘導期早期即發生紅斑、水腫、丘疹等反應，並在激發期再次出現同樣等級的反應，表明該受試者在試驗前已被該樣品致敏，記為前致敏狀態（Pre-sensitization）。如果在誘導期出現輕度反應（1～2分），而激發期未再現，為該樣品重複刺激造成的刺激反應（Irritation）；如果受試者在激發期的反應較誘導期明顯增強，表示該樣品在試驗期間誘導出這位受試者的過敏反應，提示這種產品具有潛在致敏性，記為誘導過敏（Induction of Sensitization） [5]。
Henderson 和Riley 對HRIPT的結果進行過統計學推算，假設在樣本量為100的人群中進行HRIPT檢測，如果結果為陰性，那麼在同樣情況下使用這些產品時，在人群中產生過敏反應的幾率*大不會超過2.9%[2]。需要注意的是，因為HRIPT是在增加濃度和封閉的情況下測試，實際使用時過敏率更低，根據Hall等[6]的估計，化妝品誘導出皮膚過敏的機率約為0.09%。因此，HRIPT的陰性結果可以作為確證實驗來證實化妝品的安全性。
3 討論
人重複性損傷性斑貼試驗（Human Repeated Insult Patch Test， HRIPT）自1944年被Schwartz和Peck提出以後，經過不斷的改良，目前已經被認為是評價新材料或消費品對人體致敏性和刺激性的*可信方法。HRIPT在歐美的使用率是*高的，經濟與合作發展組織（OECD）和EU試驗指南中這兩種試驗也是優選的方法，並可以在其他方法獲得數據不足的時候作為確證試驗[2]。HRIPT具有封閉性，可以模擬並放大人體實際使用過程，現已證實封閉式試驗優於皮內注射和開放式局部應用的方法，具有足夠的敏感性，能檢測出絕大部分的致敏物[7-8]。
HRIPT在誘導期，每次斑貼持續24h，然後間隔24h或48h讀結果，並進行下一次斑貼，可以使前一次斑貼造成的皮膚反應充分顯現。誘導期結束後2周的休息期則使得各種免疫反應可以充分進行，並且此時誘導期的過敏反應通常都已消失，不會對激發期產生干擾。所用檢測物的濃度設定通常建議採用不引起刺激的*高濃度，這個濃度是從之前人體刺激性試驗、過敏原測試和人體重複應用試驗中的數據中獲得，有時還需要結合試驗設計考慮，如對實際應用中濃度放大數倍或者參照誤用後濃度進行檢測。通過採取劑量依賴性研究甚至可以了解通過減少劑量是否能達到安全的使用量，即反應誘發閾值（response elicitation threshold）[9]。這些特點都使得HRIPT具有更高的敏感性。在本研究中，11種產品在激發期都沒有出現陽性反應，但在誘導期有1～9人對5種樣品1、4、5、7、12、13和14中出現輕度紅斑反應，提示在實際使用過程中，重複外用這幾種化妝品可能具有一定的刺激性。但這個結果只有通過HRIPT才能夠發現，因為傳統的斑貼試驗是單次試驗結果判讀，就會得到類似誘導期的陰性結果。再次證明HRIPT的敏感性和在化妝品安全性檢測中的重要意義。
斑貼試驗的結果受到諸多因素的影響，如稀釋受試樣品的基質、樣品濃度、所用樣品的量、封閉方式等都可能影響，產生假陽性或假陰性的結果[10-11]。通常情況下，對於乳液、爽膚水等可在皮膚上長期駐留的產品可以選擇用未經稀釋的原液進行斑貼。而對於潔面乳這種洗脫類產品，由於在實際使用中會被大量的水沖洗掉，選擇用蒸餾水進行稀釋，用1%的稀釋液進行斑貼。即使這一濃度也大於實際使用中人體對這種化妝品的暴露濃度[12]。此外，封閉式斑試器也起到對受試樣品暴露的放大作用。而對於卸妝乳，其油溶性成分含量較高，通過以油溶油的原理去除彩妝，本身性質比較溫和，某些按摩油本身也具有卸妝的作用，可以在面部長期駐留。因此需要根據產品本身的性質判斷濃度和斑貼方式。本研究中有3種卸妝乳，考慮到放大效應，對3、5號選擇了封閉式斑貼，11號因為含有較多量表面活性劑，與12～14號潔面乳一樣選擇了半封閉斑試器進行試驗。結果只有5號有輕度的刺激反應，無過敏反應出現，說明在實際應用中是很安全的。
在進行多樣品斑貼試驗時還需要注意激動皮膚綜合徵（excited skin syndrome）， 是由於皮膚對於某個樣品包括對於斑貼所用的膠帶等產生的強烈反應，可能會誘導出高激惹狀態（俗稱「激惹的後背」），從而使得其他樣品也出現輕度的陽性反應[13]。在本研究中，我們觀察到一些受試者對試驗用的膠帶或陽性對照產生比較強烈的反應，同時多個其他樣品點也表現為輕度紅斑反應，可能也受到了激動皮膚綜合徵的影響，對於膠帶或陽性對照的強陽性反應也可能增加了樣品刺激反應率。
總之，HRIPT 通過採用延長暴露時間，採用較高使用濃度和封閉斑貼的方法，達到一種比實際使用時的放大效果，並可以檢測出極微弱的刺激反應，提示在實際使用時可能出現的風險。HRIPT的陰性結果可以證明人體不會對特定產品或配方產生不良反應。儘管如此，需要注意的是：出於倫理方面的考慮，HRIPT試驗並不用於預測或者篩選鑑定潛在的致敏原，而主要作為確證試驗，在放大應用的條件下來檢測配方中的過敏原，保證產品在面對消費者應用時的安全性。
關注微信公眾號（檢測的隔壁老李）了解更多亞馬遜規則