作者：呂金明1 王亞磊2 彭新國2 尹洪民3
單位：1.山東省濱州市立醫院檢驗科；2.山東濱州醫學院附屬醫院檢驗科；3.山東濱州醫學院煙台附屬醫院消化內科
摘要
目的 研究外周血T淋巴細胞及細胞因子與幽門螺旋桿菌（HP）感染和自身免疫性肝病（AILD）的相關性。方法 連續選擇入我院首次診斷為AILD患者共60例，採用13C尿素呼氣試驗（13C-UBT）檢測HP感染；流式細胞術法檢測外周血中T淋巴細胞亞群百分含量；全自動生化分析儀檢測肝功能指標，包括谷丙轉氨酶（ALT）、穀草轉氨酶（AST）、鹼性磷酸酶（ALP）和谷氨醯轉肽酶（GGT）水平；ELISA法檢測血清細胞因子IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF-α水平。結果 共檢出HP陽性37例（61.67%），HP陽性感染患者外周血中CD3+、CD3+CD8+淋巴細胞百分含量明顯低於HP陰性者，差異有統計學意義（P＜0.05）。HP陽性感染患者的ALT、AST、ALP和GGT水平與HP陰性者比較無差異（P>0.05）。HP陽性感染患者的IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF-α水平明顯高於HP陰性者，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 自身免疫性肝病患者幽門螺旋桿菌感染陽性率較高，與其T淋巴細胞亞群百分含量降低和細胞因子水平升高密切相關。
自身免疫性肝病（AILD）主要由於機體免疫系統過度激活，導致肝臟炎症反應、肝細胞、膽管壞死等一系列慢性、進展性肝臟疾病[1]。分為原發性膽汁性肝硬化(PBC)、自身免性肝炎(AIH)和原發性硬化性膽管炎(PSC)三種，與微生物感染、生物異源性物質、營養不良、疫苗接種、紫外線照射以及環境因素等密切相關[2]。隨著生物化學、免疫學及組織病理學等檢測技術的進步，AILD的檢出和診斷率逐漸提高。幽門螺桿菌（Hp）是定植於胃和十二指腸的革蘭陰性桿菌，Hp感染是導致消化性潰瘍的主要因素[3]。此外，Hp也可以在肝臟、腎臟等部位存在，可能與AILD的發生有關[4]。T細胞在維持體內免疫環境穩態與阻止自身免疫性反應中發揮重要的作用[5]。本研究旨在分析外周血中T淋巴細胞亞群及細胞因子含量在Hp感染和AILD的相關性，為AILD的臨床診療提供新思路。
一、研究對象與方法
1.研究對象：連續選擇2018年01月至2018年12月入我院首次診斷為AILD患者共60例，其中PBC診斷參考2009年美國肝病學會（AASLD）標準，AIH診斷參考2010年AASLD標準，PSC診斷參考Mayer標準。排除自身免疫性疾病、肝癌、病毒性肝炎、酒精性肝炎、萎縮性胃炎、胃潰瘍、妊娠及哺乳期婦女。其中男性39例，女性21例，年齡45~78歲，平均（58.7±13.6）歲。
2.研究方法：採用13C尿素呼氣試驗（13C-UBT）檢測HP感染，流式細胞術法檢測外周血中T淋巴細胞百分含量；全自動生化分析儀檢測肝功能指標，包括谷丙轉氨酶（ALT）、穀草轉氨酶（AST）、鹼性磷酸酶（ALP）和谷氨醯轉肽酶（GGT）水平；ELISA法檢測血清細胞因子IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF-α水平。
（1） 13C-UBT方法：受試者清晨空腹（禁食8h，禁飲4h），正常呼吸，防倒流的氣體導管插入CO2集氣瓶瓶中，緩慢呼氣4~5s（嚴禁倒吸，避免液體濺出），拔出導管，加入稀釋閃爍液，迅速擰緊，為0min呼氣。用少量涼水（20ml）送服1粒13C顆粒，靜坐30min後，按上述方法收集呼吸氣。採用北京華恆安邦科技有限公司提供的HG-IRIS200型13C紅外光譜儀和北京勃然製藥有限公司提供的13CO2試劑盒進行檢測，以13C 計數（30min/0min）≥4為陽性，＜4為陰性。
（2） 流式細胞術：流式細胞術（FCM）檢測淋巴細胞亞群數量：空腹抽取受試者2 ml外周血，EDTA-Na2作為抗凝劑。加淋巴細胞分離液用密度梯度離心法分離單個核細胞層。用適當的RPMI 1640培養基將單個核細胞再懸浮並計數。調節培養基用量，使細胞濃度約為2×106/ml。於在流式細胞術專用EP管中加100ul細胞懸液，加20ul對應的一組螢光標記單克隆抗體，吸吹混勻，室溫避光反應30min，加1ml Hanks液500/min離心8min後洗滌一次，再加1ml Hanks液充分混勻，應用FCM上機檢測10000個細胞，應用bd diva軟體分析淋巴細胞的百分含量。
（3） ELISA法：根據試劑盒說明書進行標本稀釋及加樣：將試劑盒恢復到室溫，空腹抽取受試者2 ml外周血進行血清分離，血清稀釋後加到反應區孔內，同時加到反應區孔內不同濃度的細胞因子，制定標準曲線；溫育及洗板：加樣板的凹槽里，蓋上生物薄片，室溫（20℃）孵育30min後，用緩衝液沖洗，加入100μl的細胞因子酶標抗體，室溫（20℃）溫育30min，沖洗；顯色與終止反應：在反應孔內加入顯色劑，室溫反應15 min後加終止液終止反應；用酶標儀進行濃度檢測後換算出相應細胞因子的濃度。試劑盒購自sigma 公司, St. Louis,MO,USA。
3. 統計學方法：採用SPSS20.0軟體進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較採用獨立樣本t檢驗，計數資料以例數或%表示，組間比較用χ2檢驗；P＜0.05認為差異有統計學意義。
二、研究結果
1.HP陽性率分析：共檢出HP陽性37例（61.67%），陽性感染者的HP比值為4.1~7.6，平均（5.8±1.3）。
2.受試者T淋巴細胞亞群分化抗原的比較：HP陰性感染患者的CD3+、CD3+CD8+細胞明顯高於HP陽性者，差異有統計學意義（P<0.05）。CD3+CD4+細胞、CD4+/CD8+細胞比值，HP陽性感染患者與HP陰性者差異無統計學意義（P>0.05）。見表1
3. 肝功能指標水平比較：HP陽性感染患者的ALT、AST、ALP和GGT水平與HP陰性者比較無差異（P>0.05）。見表2
4. IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF-α水平比較：HP陽性感染患者的IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF-α水平明顯高於HP陰性者，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3
三、討 論
AILD可通過肝功能檢查進行初步診斷，ALT和AST大幅升高，提示肝細胞受損較重，但是常規指標很難把AILD與病毒性肝炎鑑別出來，誤診或漏診率較高，導致AILD患者長期無法治癒，嚴重影響預後[6]。AILD患者免疫耐受機制喪失，誘導T淋巴細胞介導的肝臟靶抗原損傷等[7]。HP含有一些細胞毒素相關蛋白，最重要的一種毒力蛋白因子就是-cagA[8]。當觀察到疾病患者的HP呈陽性時，其濃度可能會增加，大量的cagA可能會相應地轉移到胃粘膜上皮細胞。細胞下游的信號通路因此被激活，導致感染症狀加重，從而誘導細胞免疫反應[9]。當病人處於一定的免疫耐受狀態時，其防禦能力會降低。因此，很容易導致內毒素血症，導致肝臟炎症損傷[10]。
AILD患者中與HP陰性感染患者相比，HP陽性感染患者外周血中總的T淋巴細胞特徵性標誌的CD3+淋巴細胞、CD3+、CD8+淋巴細胞的含量明顯減少（p<0.01），而CD3+、CD4+淋巴細胞的含量和CD4+/CD8+淋巴細胞比值，差異無統計學意義（p>0.05），CD4+是輔助性T淋巴細胞的重要表面標誌，通過識別並結合MHCⅡ類分子分泌細胞因子，並協助其它細胞參與免疫應答。據報道，HP感染後，可引起人體免疫功能紊亂，血漿炎性介質被大量釋放，加重炎症，導致肝組織損傷，與自身抗體發生反應形成免疫復合物，進而造成免疫性肝病[11-12]。HP感染可增加肝細胞壞死或凋亡發生，使淋巴細胞浸潤到肝內膽管，加速發生肝硬化[13-14]。
通過該研究得出AILD患者中HP陽性率為61.67%，並且HP陽性感染患者血液中的IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF-α含量明顯高於HP陰性者，差異有統計學意義（P<0.05），提示，自身免疫性肝病患者幽門螺旋桿菌感染陽性率較高，與多種免疫性抗體陽性和細胞因子水平升高密切相關。通過對HP的早期檢測和干預可提高AILD的診斷準確率和臨床治療效果。然而，上述結果在大樣本臨床環境下仍需進一步確認，以獲得具體結論。
參考文獻略
註：本文來源於《臨床實驗室》2020年第4期「生化」專題