基質輔助雷射解吸/電離（MALDI）成像質譜（IMS）是一項強大的技術，可通過一次實驗研究整個組織切片中數千個分子的空間分布。由於蛋白質代表組織和細胞中重要的功能分子組，因此蛋白質成像已成為IMS技術和方法發展的重點。蛋白質譜鑑定對於分子成像數據的生物學環境至關重要。然而，MALDI產生的蛋白質的氣相碎裂效率，使得直接從組織中進行蛋白鑑定變得困難。MALDI成像質譜系列文章重點介紹與蛋白質譜鑑定相關的方法和技術，這些方法可以用於克服MALDI IMS實驗中蛋白質譜鑑定遇到的挑戰。
自1990年代後期引入基質輔助雷射解吸/電離成像質譜儀（MALDI IMS）以來，該技術的實用性得到了迅速的增長，MALDI IMS被用於分析從植物，昆蟲到哺乳動物等生物樣本的蛋白質譜鑑定。MALDI IMS可以對樣品表面的數千種物質進行無標記的多重分析，生成二維分子圖，實現對內源性物質的定位及丰度測定。MALDI IMS已用於多種物質的研究，包括代謝物，藥物，脂質，肽和蛋白質。由於蛋白質在細胞過程中扮演的角色，而 MALDI IMS允許在單個成像實驗中可視化蛋白質及其各種蛋白形式（即不同的翻譯後修飾），因此蛋白質成像技術引發了廣泛關注。如下圖中所示，首先使用MALDI基質將整個組織切片進行覆蓋，該基質有助於在雷射輻照期間內源性生物分子的解吸和電離從而實現MALDI IMS。然後，在離散的x，y坐標處收集各個質譜圖，以便在整個樣品區域上繪製信號強度圖，從而創建離子圖像。單個MALDI IMS實驗可產生數千個離子圖像，從而為經典組織學分析提供了分子生物學基礎。碎片化的數據信息通過獨立的實驗收集，可以直接從組織中收集，也可以在提取後通過LC-MS /MS進行收集。
圖註：蛋白質成像的MALDI IMS工作流程概述。（a）將組織樣品切成薄片，洗滌以除去干擾鹽和脂質，並用MALDI基質均勻包被。樣品製備後，將樣品加載到儀器中，然後用雷射照射該部分，並移動定義的橫向距離，該距離決定了圖像的空間解析度。（b）在每個像素位置產生質譜圖譜。（c）在採樣的組織區域內的坐標系中繪製選定質量範圍的離子強度，以創建離子圖像。（d）在IMS實驗之後或與之並行進行的正交實驗是為了獲取可以與成像數據相關的蛋白質鑑定數據。
MALDI IMS中的蛋白質鑑定對於幫助理解生物分子和細胞系統的生理作用至關重要。但是，MALDI產生的離子通常處於低電荷狀態，大大降低了它們的氣相碎裂效率，從而限制了序列覆蓋範圍，因此想要實現對許多成像實驗中觀察到的蛋白質進行鑑定還充滿了挑戰。質譜分析中的蛋白質譜鑑定常使用自下而上或自上而下的方法。自下而上的蛋白質鑑定方法依靠酶消化將較大的蛋白質水解為更易於片段化的較小肽，從而獲得更高的序列覆蓋率。在自上而下的方法中，將完整的蛋白質注入質譜儀中並進行片段化，無需事先消化。除了更好地跟蹤蛋白質修飾之外，自上而下的蛋白質鑑定優勢在於，它可以通過對完整蛋白質的質量進行測量來對成像進行補充，該完整蛋白質與MALDI IMS產生的信號更直接相關。
對於自下而上和自上而下的蛋白質組學實驗，通常使用碰撞誘導解離（CID）或電子轉移解離（ETD）來使蛋白質和肽片段化。在CID中，離子被加速並與中性氣體碰撞，從而導致離子的內部能量增加。如果沉積的能量超過鍵的臨界能量，則會發生斷裂。「移動質子模型」用於描述CID研究中蛋白質和多肽的解離。該模型假設高電荷蛋白質的序列片段是由質子動員到肽主鏈上的羰基後的電荷定向斷裂產生的。但是，MALDI主要產生帶有少量質子的低電荷態離子，這些離子傾向於被隔離在高鹼性胺基酸側鏈上（例如Lys和Arg）。因此，MALDI產生的蛋白質離子片段具有較差的序列覆蓋率。在ETD中，離子會在離子阱中被自由基陰離子轟擊，從而導致電子轉移並形成自由基陽離子。一旦形成自由基陽離子，沿肽主鏈發生快速解離，產生信息序列片段。ETD要求存在多個質子，並且給定蛋白或肽的片段化效率與電荷狀態的增加高度相關。由於這些原因，ETD對MALDI產生的蛋白質的適用性也受到限制。
為了克服這些問題，實現對MALDI生成的蛋白質進行蛋白質譜鑑定的一些新的方法和技術也應用到基於MALDI IMS蛋白質譜鑑定。這些方法和技術通過在MALDI圖像分析後或使用一系列組織切片的方式進行。比較常見的方式是，通過從組織中提取蛋白質，結合電噴霧電離（ESI）對樣品進行分析。ESI能夠產生高電荷的離子，這些高電荷的離子更適合CID和ETD裂解。通過這些補充方法，可以使用更傳統的蛋白質組學工作流程進行蛋白質鑑定，並且可以通過精確的質量匹配將所得鑑定與成像數據相關聯。
MALDI IMS儀器和樣品製備方法的發展使常規成像技術可以對組織中的肽和蛋白質進行成像。為了充分闡明這些圖像所代表的基本生物學特性，可以採用鑑定來自IMS實驗的蛋白質信號的方法。正交、空間靶向的蛋白質組學技術和方法的發展使得肽和蛋白質的識別更加可信，推動了蛋白質IMS技術在下一代生物應用中進一步的使用。該領域的重點是結合技術以在更高的空間解析度下最大限度地提高靈敏度和破碎效率。例如，儀器源可以更好地控制源壓力，可以提高高性能成像平台上完整蛋白分析的靈敏度。採用電荷狀態無關的離子活化技術（例如紫外光解離）使MALDI直接從組織中對完整蛋白質進行空間靶向碎片化，能夠可視化蛋白質組並最終更深入地了解病理相關過程的方法。通過提供在完整組織中發現的動態分子相互作用和蛋白質網絡的空間環境，這將開創系統生物學的新紀元，為探索疾病擾動的系統和藥物靶標發現提供了新的可能性。
本文由北京百泰派克生物科技編輯整理，資料來源：
Ryan, 2019, Protein identification strategies in MALDI imaging mass spectrometry: a brief review
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