在 20 世紀 60 年代，核酸測序技術尚未面世，那時人們通過凝膠電泳、以及化學分析等方法，發現不少富含尿苷的非編碼 RNA，並將它們命名為 URNA，比如 U1、U2、U3 等。
20 世紀 80 年代，人們發現其中一些小核 RNA（snRNA），比如 U1、U2、U4、U5 和 U6 可以催化 mRNA 的剪接。
而另一些小核 RNA 比如 U3、U8、U13、U14 等，則可以結合 rRNA/snRNA，並能誘導後者的加工和修飾。這些小核 RNA 也被稱為 snoRNA 和 scaRNA（下稱 snoRNA）。
20 世紀 90 年代起，隨著基因組測序和生物信息學逐漸成為研究生物學的核心技術，人們意識到在人類基因組中存在著一大類 snoRNA，它的種類超過 2000 種。
一部分 snoRNA 通過鹼基配對，能和靶標 RNA 發生結合，並能引導靶標 RNA 的化學修飾，比如 2'-O 核糖甲基化和假尿苷異構化。而大多數 snoRNA 並不擁有已知的靶標，因此也被稱為「孤兒 RNA」。
近年來，學界開始將 snoRNA 與各種生理狀態和疾病聯繫起來。比如：
印記 snoRNA 簇「孤兒 SNORD116」的缺失，會引起普拉德-威利綜合症（Prader-Willi Syndrome）的發生。該位點有一種獨特的表觀遺傳現象——遺傳印記。其中，每個基因的兩個拷貝，僅僅表達父本或母本。
印記簇 D113/D114 的突變，則會導致另一種神經發育疾病 Kagami-Ogata 綜合症的發生。
SNORD118（U8）的突變，會導致伴有鈣化和囊腫的白質腦病（LCC，Leukoencephalopathy with Calcifications and Cysts）的發生。
SNORA31 的變異，則會損害皮質神經元對於單純皰疹病毒的內在免疫力，進而引發單純皰疹腦炎。
此外，也有研究將 snoRNA 與癌症、代謝疾病、長壽等聯繫起來。過去三十年間，「孤兒 snoRNA」的靶標、以及它們在發育與疾病中的作用機制一直懸而未決。
十幾年前，當美國南加大教授魯志鵬在讀博的時候，就開始關注「孤兒 snoRNA」的問題。
圖 | 魯志鵬（來源：魯志鵬）
長期以來，針對 RNA 結構和相互作用的研究，嚴重依賴於物理學方法比如核磁共振、X 射線衍射和冷凍電鏡。這些傳統方法並不適用於絕大多數細胞內的 RNA，因為它們的構象過於複雜多變。
大概在十年前，魯志鵬想出一種新策略：使用化學交聯和臨近連接的辦法，抓住細胞內空間臨近的 RNA 片段。
理論上來說，這種空間距離的測量可以完全重建細胞內 RNA 的結構和相互作用。「想出這種策略之後我非常激動，我相信這一方法如果成功的話，將會開創一個新的領域，並解決很多 RNA 生物學的關鍵問題。」魯志鵬說。
後來，他一邊做博士的課題，一邊暗地裡嘗試上述想法。彼時，他的博士導師也允許他自由探索。
博士畢業之後，魯志鵬帶著自己開創的課題，來到史丹福大學從事博後研究。後來，他很快就實現了這個想法，並把相關技術命名為 PARIS（Psoralen Analysis of RNA Interactions and Structures）。
由於這一方法的英文簡稱和法國的首都巴黎同名，因此他和同事為相關論文專門設計一個別具一格的封面圖，即使用 RNA 二級結構來描繪巴黎艾菲爾鐵塔。
（來源：Cell）
在 2016 年這篇論文中，他和同事發現通過 snoRNA U8 結合 rRNA，可以指導 rRNA 的加工，從而揭示 LCC 這種神經退行性疾病的分子機制。
後來，這篇論文不僅登上 Cell 封面，還登上 Cell 2016 年論文精選集的封面（Best of Cell 2016）。
很多其他期刊比如 Nature Methods、Nature Chemical Biology、Molecular Cell、Trends in Biochemical Sciences 等也都專門發表評論。
加入南加州大學成立獨立實驗室之後，魯志鵬重新設計了上述流程中的幾乎所有步驟，並疊代出第二版 PARIS2，將效率提升了 4000 多倍[2]。
他說：「雖然我在 2018 年才在南加州大學獨立建組，但在某種程度上我在 2013 年博士畢業之前就已經獨立。我經常告訴學生，只要你敢想敢幹，任何人都可以開創新領域，我也非常支持他們嘗試全新的想法。」
同樣在 2018 年，魯志鵬團隊的第一位博士後張敏傑開始繼續研究「孤兒 snoRNA」的問題。
一開始他們專注於相關方法的開發，期間發表了一篇關於 PARIS2 的論文[2]、以及一篇關於 CRSSANT 計算方法的論文[3]。
大約三四年前，他們終於在方法學上做好準備，開始正式解決「孤兒 snoRNA」的問題。
但是，哪怕使用效率較高的 PARIS2 方法，課題組也耗時一年多之久，才從多個細胞系之中獲得足夠的測序覆蓋率。
期間，他們使用多種的細胞類型，來增加發現更多 snoRNA 靶點的機會。 2020 年底，他們終於獲得 snoRNA 與 tRNA 結合的第一個證據。
大約在同一時期，另一支課題組發表了一篇論文，該論文表明兩種 snoRNA 可以與 tRNA 結合。「但是，上述論文並未進一步研究其功能。而我們的工作則對上述證據進行了獨立驗證。」魯志鵬說。
在發現 snoRNA-tRNA 的相互作用之後，他們同時探索了多個方向，並發現 snoRNA-tRNA 的互作可以調控 tRNA 修飾、tRNA 穩定性、水平和活性、蛋白質翻譯、細胞生長、以及幹細胞的多能性和分化。
通過本次研究他們進一步擴展了對於 snoRNA 靶點和功能的理解[1]。而使用高度優化的新一代方法 PARIS2，他們發現 7000 多個 snoRNA 靶標，包括各種類型的非編碼 RNA，其中大約 1000 個涉及到 snoRNA-tRNA 的相互作用。
接著，在多種方法的幫助之下，課題組進一步將本次新發現的 snoRNA 靶點加以驗證。
其中一部分 snoRNA 靶點在很多物種中呈現高度保守的特點，儘管它們與真核生物已經分開超過 15 億年，但是它們甚至存在於一些古菌類群中。
作為翻譯機器的核心零件，tRNA 的種類、數量和化學修飾狀態，在不同細胞、不同組織器官和不同發育時期均會受到嚴格調控，從而直接影響蛋白質的表達、代謝、以及生物的生長發育過程。
在「細胞經濟學」之中，對於 tRNA 供應和密碼子使用來說，這種供需之間的動態平衡，是一種翻譯優化方面的基本原則。然而，對於這種平衡的調節機制和功能，人們依舊不清楚。
而該團隊發現：snoRNA-tRNA 的相互作用網絡，控制著多種的 tRNA 修飾，包括 tRNA 2'-O-甲基化以及很多其他修飾。
snoRNA 及其結合的 2'-O-甲基轉移酶 FBL 的缺失，會誘導產生一大類新的調節性 RNA-tRNA 片段。
而 CRISPR 敲除 snoRNA D97/D133 家族之後，會顯著降低 tRNA 的活性和水平，包括參與延伸過程的（e）Met-CAU，進而改變轉錄翻譯過程之中密碼子的識別。
HEK293 細胞中的 D97/D133 單敲除和雙敲除，則會抑制富含甲硫氨酸（Met）等增殖相關基因的表達，不過也會促進 Met 含量較少的基因的表達。
更有意思的是，snoRNA-tRNA 修飾網絡的起源並非偶然，可能來源於生命對氧化應激的防衛，這也是一個絕大多數物種進化中所必須面對的難題。
蛋白質中的甲硫氨酸（methionine），是少數幾種在氧化之後可以原位修復的胺基酸。這一特性會被所有物種用於保護蛋白質免受氧化損傷，類似於軍事裝備中所常用的「反應裝甲」，或者 X 戰警的金剛狼一樣進行「自愈」。
長壽命的或者接近活性氧的蛋白質，往往和細胞生長增殖相關，並會使用更多的甲硫氨酸。而調控發育的蛋白質壽命一般較短，相對來說含有更少的甲硫氨酸。
這就導致甲硫氨酸所對應的 tRNA（eMet-tRNA），成為調控生長與發育的關鍵。而任何影響 eMet-tRNA 的機制，都會直接影響這兩個往往互相對立的生命事件。
圖 | snoRNA 基本原理以及 PARIS2 捕獲的部分 snoRNA-tRNA 相互作用網絡（來源：資料圖）
該團隊還發現在小鼠胚胎幹細胞發育模型中，snoRNA D97/D133 的敲低和敲除，會促使其傾向分化為中胚層和內胚層（例如心肌細胞）。
而這對於胚胎幹細胞的多能性並無影響，甚至會產生增強多能性的趨勢。這一發現也與人類細胞中促進發育相關基因的表達機制一致。
同時，對於心臟損傷與疾病的治療，本次研究也能帶來重要的啟示。通過調控 snoRNA 的活性，可以快速製造成熟的心肌細胞，以便加快在再生醫學方面的應用。
總而言之，本次研究首次揭示一個全新的 snoRNA-tRNA 互作網絡，闡述了 snoRNA 控制 tRNA 修飾、穩定性、密碼子偏好、翻譯效率、以及幹細胞發育的機制。
同時，這項研究涵蓋了多個主題，從新技術開發、到 snoRNA 靶標的發現、多種類型的驗證、在人和老鼠胚胎幹細胞中的功能分析、以及 tRNA 加工和翻譯調控的機制研究等。
圖 | 敲除 D133 既增強幹細胞多能性又加速其分化（來源：資料圖）
最終，相關論文以《snoRNA-tRNA 修飾網絡控制密碼子偏倚的細胞狀態》（A snoRNA–tRNA modification network governs codon-biased cellular states）為題發在 PNAS[1]。
張敏傑（現天津醫科大學教授）、南加州大學博士後李孔潘與白建慧是共同一作，魯志鵬擔任通訊作者。
圖 | 相關論文（來源：PNAS）
魯志鵬表示：「在科研之外，本次 PNAS 論文的作者們也在『人類遺傳學』方面也取得了很多成就。在過去五年里，我的實驗室成員總共生了四個孩子。」
而在目前，課題組正在人誘導多能幹細胞之中，測試 D97/D133 snoRNA 的功能，相信快速產生人誘導多能幹細胞衍生的成熟心肌細胞，將為治療人類心臟損傷帶來幫助。
而全局性 snoRNA-tRNA 互作網絡的發現表明：除了 D97/D133 之外，還有更多 snoRNA 參與 tRNA 的調節，繼而參與各種生理狀態下的選擇性翻譯調節。
該團隊相信對該網絡進行更深入的機制研究，將能揭示更多關於幹細胞功能和動物發育的調節因子。預計這些新的 snoRNA 調節因子將成為重要的治療靶點，其影響範圍將遠遠超出再生醫學領域。
另據悉，人類基因組編碼 2000 多種 snoRNA，其中許多在真核生物甚至古細菌中都呈現出高度保守的特點。超過 7000 種新 snoRNA 靶標的發現、以及它們在 tRNA 代謝和發育中的作用，開啟了無限的可能性。
對於 snoRNA 引導的 tRNA 修飾的機制人們尚不清楚，例如鹼基配對之外的靶標是如何選擇的、以及在不同的生物背景下修飾水平是如何調節的。
對於 snoRNA 引導的 tRNA 修飾，它們如何影響其他 tRNA 修飾和 tRNA 穩定性？snoRNA 和相關修飾酶丟失後 tRNA 片段的功能是什麼？對於低修飾的 tRNA，它們如何影響翻譯？哪些 mRNA 的翻譯水平負責幹細胞中觀察到的表型？
除了研究這些問題之外，魯志鵬團隊也在考慮一些更加宏觀的問題。他說：「我們的長期目標是里解所有 snoRNA 的功能和機制。
儘管我們發現了許多不同類型的 RNA 靶標，但目前對 snoRNA 靶標的描述仍然有限。」
當然，很有可能還有更多的 snoRNA 靶標等待挖掘。「因此一個特別有趣的方向是研究 snoRNA 與遺傳疾病的聯繫。儘管我們已經發現 LCC 中 U8 突變的影響，但遺傳性疾病中其他 snoRNA 的靶標仍然未知。」魯志鵬說。
此外，由於外顯子組測序、SNP 作圖的範圍有限，人類遺傳學檢測出的導致疾病的非編碼變異很少。因此有充分的理由相信大量的 snoRNA 與未知的人類遺傳有關。找到這樣的聯繫不僅可以解開醫學之謎，還可以帶來新的治療方法。
當前，RNA 生物學的發展正處於一個非常激動人心的時代，特別是靶向 RNA 治療備受歡迎。2023 年，研究新冠病毒 mRNA 疫苗的兩位科學家獲得了諾貝爾獎。
事實上，過去幾年間該領域還取得了許多令人興奮的進展，包括靶向 RNA 針對多種人類疾病的反義寡核苷酸和小分子藥物。
幾乎所有大型製藥公司都建立了 RNA 醫學項目，許多頂尖大學和研究機構都很支持 RNA 醫學計劃。
「因此我們很高興自己的工作能為 RNA 醫學的發展做出貢獻。我們所開發的獨特工具，為解決棘手的 RNA 生物學問題和以 RNA 為靶點的藥物開發奠定了堅實的基礎。」魯志鵬說。
幾年前，該課題組開啟了和諾華公司的合作，合作目標旨在開發能用於治療 X 連鎖遺傳疾病的 RNA 靶向藥物。目前，魯志鵬團隊也正在揭示針對 RNA 病毒感染和神經發育障礙等疾病的新型 RNA 靶點。
參考資料：
1.Zhang, M., Li, K., Bai, J., Van Damme, R., Zhang, W., Alba, M., ... & Lu, Z. （2023）. A snoRNA–tRNA modification network governs codon-biased cellular states.Proceedings of the National Academy of Sciences, 120（41）, e2312126120.
2.Zhang et al. 2021, Nature Communications
3.Zhang et al. 2022 Genome Research，CRSSANT