本研究對33名消化道腫瘤患者的腹水和腹腔沖洗液細胞學樣本進行了NGS檢測，同組織樣本檢出的基因突變進行了比較，發現細胞學樣本和組織樣本檢出基因突變的總體一致性為25%。腫瘤細胞含量>2%的細胞學樣本可檢出致病性突變，敏感性為69.2%。胰腺癌患者腹水樣本分別有33%、13%和7%的KRAS、TP53和CDH1突變陽性，胃癌患者腹水樣本分別有25%、12%和13%的KRAS、TP53以及APC突變陽性。
研究背景
對於腫瘤患者，可以通過收集脫落的細胞成分或抽吸法採集樣本用於細胞學診斷。腹水和腹腔沖洗液是消化道腫瘤患者細胞學樣本的常見來源。腹水是腹腔內液體的異常聚集，可由癌症和其他疾病引起，包括肝硬化、心力衰竭、慢性腎功能衰竭和腹膜感染。對腹水進行細胞學檢查可以確定是否存在惡性細胞。向腹腔灌注生理鹽水沖洗獲得腹腔沖洗液進行細胞學檢查可以發現消化道腫瘤患者的隱匿癌細胞。腹膜轉移是消化道腫瘤症患者最常見的復發模式和死亡原因，因此腹腔沖洗液細胞學檢查對於確定這些患者的腫瘤分期和預測復發非常重要。
細胞學樣本容易獲取，便於重複採樣，但也有缺點。用於細胞學檢查的液體樣本的缺點包括細胞沉澱少、細胞群的異質性以及腫瘤細胞含量相對較低。來源於腹腔的樣本通常含有大量反應性間皮細胞和炎症細胞，導致難以檢測到相對較少的腫瘤細胞。腹腔細胞學檢查對腫瘤診斷和分型的能力相對較低，診斷敏感性在50-70%之間。一些方法能夠提高診斷精確性和敏感性，包括對樣本進行特定的腫瘤標誌物檢測。
惡性腫瘤患者的腹水和腹腔沖洗液樣本富含腫瘤蛋白和腫瘤DNA。對來源於腫瘤的DNA進行基因檢測可完善細胞學診斷。NGS檢測可以分析DNA突變，識別低丰度（AF）的致病性變異。腫瘤患者血液、尿液、滲出液和腦脊液等液體活檢樣本NGS檢測已得到臨床應用。細胞學樣本NGS檢測也顯示出臨床診斷價值，包括評估腫瘤異質性、耐藥性以及微小殘留病灶。細胞學樣本中來源於腫瘤的DNA的數量和類型不同。對腹水和腹腔沖洗液細胞學樣本進行NGS檢測可以完善病理學診斷。
本研究假設，消化道腫瘤患者腹水和腹腔沖洗液細胞學樣本NGS檢測可完善消化道腫瘤診斷。本研究中，對患者腹水和腹腔沖洗液樣本進行了NGS檢測，以探索細胞學檢查顯示惡性、疑似惡性和良性的腫瘤患者的基因組特徵。比較了細胞學樣本和腫瘤組織樣本中檢出的基因突變，以及患者臨床病理特徵。最後，本研究評估了消化道腫瘤患者腹水和腹腔沖洗液細胞學樣本NGS檢測基因突變可行性。
研究方法
對2018年1月至2020年12月間33名患者的腹水和腹腔沖洗液樣本進行了分析。這33名患者包括27名癌症患者（13名胰腺癌患者和14名胃癌患者）以及6名非惡性腫瘤患者（如腎衰竭和腹膜炎）。收集了13名胰腺癌患者、8名胃癌患者和6名非惡性腫瘤患者的腹水樣本，以及6名胃癌患者的腹腔沖洗液樣本。獲取了10名癌症患者（2名胰腺癌患者和8名胃癌患者）的配對腫瘤組織樣本，對這些樣本進行了福馬林固定石蠟包埋（FFPE）處理。對腹水和腹腔沖洗液樣本在收集後12小時內根據標準方案進行了處理（圖1）。細胞學樣本隨後用於DNA提取和NGS檢測，基因列表見表1。
圖1. 消化道腫瘤患者腹水和腹腔沖洗液細胞學檢查
表1. NGS檢測基因
研究結果
患者特徵和細胞學診斷
33名患者的基線人口統計學和臨床特徵如表2所示。這33名患者包括20名男性和13名女性，年齡從39歲到90歲不等。組織樣本和細胞學樣本採集時間間隔為0至42個月。採集了腹水的胰腺癌和胃癌患者的臨床預後較差，而採集了腹腔沖洗液的胃癌患者的預後較好，疾病穩定，隨訪期間無復發。
表2. 患者詳細信息（n=33）
細胞學和組織樣本比較分析
對10名接受了手術或活檢的患者進行了腹水/腹腔沖洗液樣本和FFPE組織樣本NGS檢測，比較了檢出的基因變異（表3）。其中，2名胰腺癌患者和5名胃癌患者採集了腹水樣本，另外3名胃癌患者採集了腹腔沖洗液樣本（圖2）。檢測結果顯示，3名患者細胞學樣本和組織樣本檢出相同的基因突變。2名胰腺癌患者的組織樣本均檢出CDH1和TP53突變，腹水樣本中也檢出CDH1突變。胃癌患者的組織樣本檢出TP53、APC、RYR2、CTNNB1、KIT、FBN2、TSC2和PIK3CA突變，配對腹水樣本中也檢出TP53和APC突變。僅在腹水樣本中檢出KRAS突變。胰腺癌患者的組織樣本檢出TP53、KRAS、CREBBP和PIK3CA突變。1名胰腺癌患者（PC1）的原發腫瘤組織樣本和細胞學樣本檢出有相同基因突變頻率高，在細胞學樣本和配對組織樣本中，致病性CDH突變丰度（AF）分別為4.6%和54.1%。腹腔沖洗液樣本未檢出突變。細胞學樣本和組織樣本檢出體細胞突變的總體一致性為25%（細胞學樣本敏感性21.43%，特異性50.00%）。
表3. 細胞學和組織樣本NGS檢測結果比較（n=10）
圖2. 腹水/腹腔沖洗液細胞學樣本和組織樣本基因突變檢測結果比較
細胞學樣本NGS檢測結果
表4顯示了腹水/腹腔沖洗液細胞學樣本的NGS檢測結果。13例胰腺癌患者腹水細胞學檢查顯示，4例為非典型性，3例為疑似惡性，6例為惡性。細胞學樣本中腫瘤細胞的百分比為0.1-10%。8例胃癌患者腹水細胞學檢查顯示均為惡性。細胞學樣本中腫瘤細胞的百分比為5-10%。6例胃癌患者腹腔沖洗液細胞學檢查顯示，1例為非典型性，1例為疑似惡性，1例為惡性，3例為陰性。細胞學樣本中腫瘤細胞的百分比為0%-1%。從6例非惡性腫瘤患者中獲取了腹水作為對照樣本，這些患者均攜帶良性變異，被視為野生型。對6名胃癌患者的腹腔沖洗液樣本和6名非惡性腫瘤患者的腹水樣本進行了NGS檢測，均未顯示突變。總體腫瘤細胞含量為~0-10%。為了確定腫瘤細胞含量為多少時NGS檢測可檢出突變，通過生成ROC曲線得出最低腫瘤細胞含量最優閾值為2%，曲線下面積（AUC）為0.833（p<0.001；圖3）。重要的是，腫瘤細胞含量>2%的細胞學樣本可以檢出致病性突變，敏感性為69.2%（9/13）。
表4. 腹水和腹腔沖洗液細胞學樣本NGS檢測結果（n=33）
圖3. 通過ROC曲線確定樣本檢出突變所需腫瘤細胞含量
腹水細胞學樣本NGS檢測結果如圖4所示。在胰腺癌患者的腹水樣本中，分別有33%、13%和7%的KRAS、TP53和CDH1突變陽性。類似地，胃癌患者腹水樣本中分別有25%、12%和13%的KRAS、TP53和APC突變陽性。
圖4. 胰腺癌和胃癌患者腹水樣本檢出的基因突變
討論
使用靶向藥物需要對患者進行基因分型，選擇可能對治療有反應的患者。使用NGS檢測進行基因分型可以確定癌症患者的治療方案並預測預後。用於基因分型的NGS檢測需要一定量的腫瘤DNA。然而，由於腫瘤位置、腫瘤擴散風險以及活檢或手術過程中的併發症，從一些患者身上獲取腫瘤組織樣本可能不可行。液體活檢對非固體生物組織取樣，如血液和體液（如尿液、唾液、腹水或滲出液）。液體活檢是組織活檢的非侵入性替代方法，並可以對癌症演化進行縱向評估。細胞學樣本是常規的液體活檢之一。細胞學樣本容易獲取，便於重複採樣，可以替代組織樣本，用於評估癌症患者當前狀態。細胞學樣本或液體活檢樣本中提取的DNA可以用於分子檢測，從而避免額外的組織活檢。細胞學樣本可以用於基因檢測和輔助診斷。
本研究評估了消化道腫瘤患者腹水和腹腔沖洗液細胞學樣本檢測基因突變的可行性。通過比較細胞學樣本和配對腫瘤組織樣本檢出的體細胞突變來確定細胞學樣本的診斷價值。細胞學樣本和組織樣本檢出突變的總體一致性為25%，細胞學樣本敏感性為21.43%，特異性為50%。腹水樣本和組織樣本的一致性為27%，而腹腔沖洗液樣本和組織樣本的一致性為0%。原發腫瘤組織樣本中突變頻率高的基因在細胞學樣本中突變檢出率也高，一名患者（PC1）腹水樣本中致病性CDH突變AF為4.6%，腫瘤組織樣本中為54.1%。比較了33例患者（27例消化道腫瘤，6例非惡性腫瘤）的基因分型結果和腫瘤細胞含量以及細胞學診斷。腹水/腹腔沖洗液樣本中的腫瘤細胞含量為0-10%，可以檢出體細胞突變的腫瘤細胞含量最優閾值為2%。值得注意的是，腫瘤細胞含量>2%的腹水/腹腔沖洗液樣本可檢出致病性突變，敏感性為69.2%。
腹水/腹腔沖洗液樣本中腫瘤細胞含量與體細胞突變檢出情況之間的關係可能受到這些樣本中大量間皮細胞和炎症細胞的影響。利用腫瘤細胞含量閾值可以提高診斷敏感性。原發性腫瘤組織樣本中基因突變頻率高，腹水/腹腔沖洗液樣本中突變DNA含量也高，因此突變負荷高的原發性腫瘤可用於細胞分子學評估。對2名胰腺癌患者的FFPE細胞塊，以及3名胃癌患者和1名結腸癌患者的腹水上清液進行了NGS檢測，結果與組織樣本一致。其他研究中，患者進行了腹水游離DNA（cfNDA）檢測，在卵巢癌和肺癌患者的樣本中檢出TP53、EGFR、ALK、BRAF突變。
據我們所知，迄今為止還沒有研究評估腹腔沖洗液細胞學樣本的NGS檢測結果。在本研究中，所有腹腔沖洗液細胞學樣本NGS檢測結果均顯示野生型，與腫瘤分期和大小無關，表明這些樣本基因突變檢測結果受非常低的腫瘤細胞含量的限制。與此相比，肺癌患者的胸腔積液樣本NGS檢測具有診斷和預後價值。這些發現表明，癌種、樣本類型、樣本中腫瘤細胞含量及原發灶基因突變狀態均可能影響細胞學樣本的基因檢測結果。
細胞學診斷常常會有不明確的結果，如非典型性。對於不確定的結果，可能需要重複採樣，以及結合臨床特徵和影像學結果來明確診斷。NGS檢測可以輔助診斷結果不明確的患者，如非典型性。一名先前診斷為非典型性的患者（PC1）的腹水樣本中檢測到體細胞突變，該患者腹水樣本腫瘤細胞含量為0.1%。細胞學診斷結果取決於樣本腫瘤細胞含量。腫瘤細胞含量很低（~0.1–0.5%）的患者判為非典型性，而腫瘤細胞含量較低（~1–2%）的患者則判為疑似惡性。細胞學樣本的腫瘤細胞含量也影響消化道腫瘤患者體細胞突變檢測結果。因此，NGS檢測在完善腹水/腹腔沖洗液樣本細胞學診斷方面受限制。不過，NGS檢測基因突變可以減少假陽性結果，因為在非惡性腫瘤患者的所有腹水樣本基因突變檢測結果均為野生型，因此排除了惡性腫瘤的可能性。
NGS檢測結果顯示，胰腺癌患者腹水樣本分別有33%、13%和7%的KRAS、TP53和CDH1突變陽性，胃癌患者腹水樣本分別有25%、12%和13%的KRAS、TP53以及APC突變陽性。由於消化道和肝膽管腫瘤中存在相似的基因突變，胰腺癌和胃癌患者沒有表現出明顯的分子差異。基於細胞學的NGS檢測結果不能確定消化道腫瘤細胞的來源，但可以反映腫瘤動態。有趣的是，在一名胃癌患者（GC3）的腹水樣本中檢測到一個原發腫瘤組織樣本中沒檢出的KRAS突變。基於細胞學樣本的NGS檢測可以反映當前的基因突變狀態和耐藥情況，輔助預後評估和疾病管理。
本研究有幾個局限。由於患者數量較少，關於消化道腫瘤患者腹水和腹腔沖洗液樣本NGS檢測有效性的結論不夠明確。在這項回顧性研究中，細胞學樣本冷凍保存可能會影響突變檢測結果。此外，術後隨訪期間發現腹水增加通常是復發的證據。在本研究中，收集配對的細胞學和組織樣本之間的時間間隔為0-42個月，這可以解釋樣本檢測結果的不同。由於腹腔內有反應性間皮細胞，腹水和腹腔沖洗液中細胞沉澱少，大多數樣本中腫瘤細胞含量占比小於2%。假陰性結果限制了細胞學樣本用於基因突變檢測和預測復發的可行性。對細胞學樣本進行NGS檢測可以為消化道腫瘤患者提供額外的信息，但需結合臨床特徵和影像學結果。
據我們所知，本研究首次評估了消化道腫瘤患者腹水和腹腔沖洗液細胞學樣本檢測基因突變的可行性。根據基因突變情況可以預測腫瘤復發和患者預後，以及確定治療方案。各種液體活檢樣本，包括滲出液、脫落細胞和沖洗液樣本，以及各種製劑，包括細胞顆粒、細胞上清液和細胞塊，可用於消化道腫瘤患者的分子評估。為了評估腹水細胞學樣本NGS檢測的臨床可行性，需要對更多有腹水的患者進行前瞻性研究。
參考文獻：
Bae GE, Kim SH, Choi MK, Kim JM, Yeo MK. Targeted Sequencing of Ascites and Peritoneal Washing Fluid of Patients With Gastrointestinal Cancers and Their Clinical Applications and Limitations. Front Oncol. 2021 Jul 15;11:712754. doi: 10.3389/fonc.2021.712754. PMID: 34336700; PMCID: PMC8319747.