首爾大學醫院近期在《Br J Cancer》期刊發表了一項研究結果，該研究對 62 名轉移性結直腸癌 (mCRC) 患者在一線姑息治療期間連續採集的272份ctDNA 血液樣本進行靶向基因（106個基因panel）測序分析，以探索液體活檢在臨床的應用效果。結果發現90.3% 的患者在治療前檢測到 ctDNA 突變。化療後的 ctDNA 清除與更長的無進展生存期（PFS）相關，而與影像學反應無關（校正後HR 0.22，95% 置信區間為 0.10-0.46）。縱向ctDNA監測發現58.1%的患者提示ctDNA分子進展早於影像學進展（中位時間3.3個月）。疾病進展（PD）的患者可檢測到多種耐藥突變（34.9%）和基因擴增（7.0%）。檢出新發突變的 PD 患者中有16.3%可能是靶向治療或臨床試驗的潛在候選者。總之，與影像學評估相比，ctDNA監測可提供更準確的腫瘤動態變化信息及個性化治療決策。
圖1、研究流程（點擊圖片可放大查看）
圖2、106個基因列表
為了更好的理解研究結果，我們先了解一下該研究是如何定義ctDNA 突變和 CNV：
從 cfDNA 樣本中檢測到原始變異後，通過PBMC(外周血單個核細胞)樣本的檢測變異信息濾除被認為是意義不明的克隆性造血(CHIP) 胚系及體系變異。ctDNA突變閾值定義為突變丰度（VAF ）≥ 0.3%且變異等位基因計數 ≥ 6，以濾除噪音、污染或測序錯誤。最後，通過肉眼觀察比較縱向 ctDNA 突變譜，用人工校正假陽性。對於CNV，定義擴增（amplifications）為拷貝數 (CN) ≥ 6，拷貝數增加（CN gains）為CN ≥ 4且統計標準P值小於 0.01。
平均 VAF 定義為計算每個樣本中檢測的所有 ctDNA 突變的 VAF 平均值。ctDNA 清除定義為基線樣本中檢測的所有高於閾值的突變或 CNV 的消失。持續的 ctDNA 清除定義為在至少兩個連續樣本檢測結果中均為 ctDNA 清除。
研究結果
患者特徵：
該研究納入 62 名 mCRC 患者。患者特徵如圖3。患者的中位年齡為 62 歲，男性占 61.3%。最常見的轉移器官依次為肝（74.2%）、肺（32.3%）、腹膜（19.4%）和淋巴結（19.4%）。患者的姑息治療方案由主治醫師酌情選擇。在 PFS 和緩解率方面，化療（FOLFOX 與 FOLFIRI）或靶向療法（西妥昔單抗與貝伐單抗）之間沒有差異。
圖3
所有患者在開始治療前都進行了基線抽血，與治療開始的中位間隔時間為 6 天。採樣間隔是在治療期間每四個化療周期之後，如果患者在沒有化療的觀察期，則大約每 2 個月採樣一次。在 11.2 個月的中位隨訪期間，共收集了 272 份血液樣本（平均每位患者 4.4 份樣本）。在研究期間共有50 名（80.6%）患者發生疾病進展，其中43 名（69.4%）患者採集到疾病進展時的血液樣本。
治療前（基線）ctDNA樣本檢測的突變譜：
在基線時，62 名患者中有 56 名（90.3%）檢測到ctDNA 變異（圖4），共包括467 個 ctDNA 突變，每位患者的中位突變數為 4.5（範圍 0-157），其中有兩名患者（一名攜帶MSI-H）的腫瘤突變負荷 (TMB) 異常高（分別有 157 和 36 個突變）。常見的突變發生在基因APC (79.0%)，其次是TP53 (79.0%)、KRAS (41.9%)、SMAD4 (21.0%)、TCF7L2 (14.5%) 和PIK3CA (12.9%)。
圖4、所有 62 名患者在治療前檢測的基因變異譜
此外，在10 名（16.1%）患者的 ctDNA 中檢測到 5 次擴增和 6 次拷貝數增加（圖5）。基於治療前的 ctDNA變異情況，攜帶RAS、BRAF、PIK3CA突變和KRAS、BRAF 拷貝數增加的患者顯示出統計學上更短的 PFS。
圖5
31 名 (50.0%) 患者在醫學中心進行了可與 ctDNA數據相比較的組織 NGS panel（FIRST Cancer Panel v.3，包括184基因）檢測。將治療前 ctDNA 測序結果與組織測序結果進行比較分析，ctDNA檢出了84.4% (114/135) 的組織突變。有一名患者的腫瘤組織檢出了擴增（ERBB2和TOP2A），在其ctDNA樣本中同樣檢出。61 名患者可獲得Sanger 測序或 NGS 檢測的KRAS和NRAS基因狀態結果。ctDNA與組織的RAS基因檢測一致率為88.5%（54/61）。七個不一致病例中有四名為僅在其 ctDNA樣本中檢出KRAS突變，這四名患者中有3名患者的ctDNA和存檔腫瘤組織樣本的基因測序突變結果完全不同（圖6）。
回顧這些患者的臨床病史，發現這三名患者都同時或先後患有另一種原發性結直腸癌。SCR40 和 SCR54 患者有兩種結腸原發性腫瘤病變。從每位患者的其他結腸病變獲取的組織測序結果與ctDNA 突變譜相同。SCR59患者先後患有兩種不同類型的結腸癌，復發時用更晚期的乙狀結腸癌組織進行的基因檢測，但腫瘤復發後獲取的 ctDNA 代表的是升結腸病變的基因突變情況。
圖6、ctDNA 與腫瘤組織突變不一致的 3 例患者
考慮到由於瘤內異質性導致的組織和ctDNA檢出突變情況不一致，研究者通過評估校正使ctDNA 和組織NGS測序結果的總體一致性增加到 86.5%，KRAS基因分型的準確性也增加到 93.4%。
ctDNA清除與治療結果：
比較了 51 名患者在每個時間點檢測到的所有 ctDNA 突變的平均 VAF值。在 51 名患者中，50 名（98.0%）患者的平均 VAF 有任何程度的下降，其中32 名患者（62.7%）在首次隨訪評估時觀察到 ctDNA 清除（圖7a）。
圖7
另外 6 名患者在治療後期（範圍 3.7-7.1 個月）獲得了 ctDNA 清除。實現 ctDNA 清除的 38 名 (74.5%) 患者的 PFS 顯著長於未達到 ctDNA 清除的患者（P< 0.001，ctDNA 清除 (+) 的中位 PFS 為 11.8 個月，ctDNA 清除(-)為 7.5 個月，圖 7b）。表現出持續 ctDNA 清除的患者在統計學上也具有更長的 PFS（P =0.002，圖 7c）。ctDNA 清除率在不同影像學反應的患者中沒有顯著差異（部分反應 (PR) 為 80.6%，疾病穩定 (SD)/疾病進展 (PD) 為 60.0%，P=0.16）。此外，化療或靶向治療的類型並不影響 ctDNA 清除。多變量分析顯示 ctDNA 清除（校正後HR 0.22）和影像學反應（校正後 HR 0.16）與 PFS 獨立相關。無論影像學反應如何，持續的 ctDNA 清除（校正後HR 0.16）與 PFS 相關。
重要的是，CT 影像學反應（PR 或 SD/PD）類型相同的患者可根據 ctDNA 清除情況表現出不同的 PFS。在 PR 患者中，達到 ctDNA 清除的患者 PFS 更長（P= 0.027，ctDNA 清除（+）的中位 PFS 為 15.9 個月， ctDNA 清除（-）為 10.7 個月，圖 7d）。 SD 或 PD 患者根據 ctDNA 清除狀況不同，PFS 也不同（P= 0.001，ctDNA 清除（+）的中位 PFS 為 10.8 個月，ctDNA 清除（-）為 3.4 個月，圖 7d）。不同持續ctDNA清除狀況的PR患者， PFS 存在較大差異（P= 0.003，持續 ctDNA 清除（+）的中位 PFS 為 19.7 個月，而持續 ctDNA 清除（-）為 10.9 個月，圖7e）。持續 ctDNA 清除 (-) 組包括未獲得 ctDNA 清除的患者和僅在單個時間點獲得短暫 ctDNA 清除的患者。
通過連續ctDNA檢測監測腫瘤疾病進展：
從51 名患者的基線到數據截止期間獲得完整的連續血液樣本。在 51 名患者中，43 名患者發生影像學進展（PD），另外8 名患者仍在觀察中，沒有任何疾病進展的證據，均處於 ctDNA 清除狀態（圖8）。
圖8、持續清除 ctDNA 而沒有疾病進展的示例
51 名患者中有 6 名在基線時沒檢測到任何的ctDNA 突變，在這些患者的隨訪樣本中也未檢出其他ctDNA 突變。 25 名（25/43，58.1%）患者的 ctDNA分子進展早於影像學進展，中位時間為 3.3 個月（範圍 1.6-12.2 個月），分子進展定義為檢測到新的 ctDNA 突變或預先存在的 ctDNA 突變丰度增加。
圖9、51 名患者從隨訪至研究結束的治療過程
在疾病進展過程中ctDNA 變化模式可分為三種：（1）治療前 ctDNA 突變的進展，（2）其他新發突變的進展和（3）未檢測到 ctDNA 突變的進展（圖 9）。在 35 名患者 (35/43, 81.4%) 中發現治療前基線ctDNA 突變增加或再次出現。20 名患者隨著腫瘤進展再次出現基線 ctDNA 突變（圖 10b），15 名患者顯示除基線突變外的新發突變（圖 10c ）。有8 名患者出現疾病進展但未檢測到 ctDNA 突變，值得注意的是這8名患者的疾病進展部位均發生肝臟以外的轉移灶。而在PD時ctDNA 升高的患者中有 74.3% (26/35)為疾病進展發生在肝臟轉移灶（P<0.001）。通過對 ctDNA 進行縱向的 CNV 監測也可表現出腫瘤的變化狀態。在治療過程中， ctDNA ERBB2（HER2）拷貝數變化顯示出與突變 VAF 相似的趨勢（圖10d）。與 HER2 陽性患者一樣，其他基因的拷貝數變化也同樣可以反映患者的病程變化。
圖10、疾病進展期的 ctDNA 突變譜示例
從 43 名 PD 患者中共確定了98 個新發生的 ctDNA 突變，其中在 15 名（34.9%）患者中發現了治療前基線未檢測到的新突變。在 98 個突變中有26 個 (26.5%) 被 ClinVar 資料庫注釋為致病或可能致病性變異，與治療耐藥相關，特別是有7名 (16.3%) PD 患者檢出的新發突變，可能是靶向治療或臨床試驗的潛在候選者。有3名患者PD 時檢測到了新的BRAF V600E 突變，該突變可能是 BRAF/MEK 抑制劑和抗 EGFR 抑制劑的靶點。然而，在這3名患者均出現與BRAF V600E共存的其他新發突變——KRAS突變（2名為 G12C，1名為 G12A） 。另一名患者檢出了BRAF V600E共存的新發PIK3CA E524K 突變。還有其他 3 名患者新發生了 RAS/MEK 通路基因突變（KRAS G12D/Q61H、NRAS Q61L/ KRAS擴增和MAP2K1 K57T）。1 名患者檢出了NF1 截短突變（ NF1 E595*），可能是靶向RAS/RAF/MEK 通路藥物的臨床試驗候選者。
此外，一些接受西妥昔單抗治療的患者在疾病進展時顯示出多種已知的耐藥突變。如圖 10c所示，患者新獲得了 4 個 RAS 通路基因突變（KRAS Q61L、NRAS Q61L、Q61K 和BRAF V600E）和 2 個EGFR胞外域突變（EGFR G465R、S492R），這些均為熟知的抗 EGFR 抑制劑西妥昔單抗的耐藥突變。同樣，其他 4 名接受西妥昔單抗治療的患者也同時檢測到影響 RAS 通路基因、EGFR和PIK3CA基因的多重耐藥突變和擴增(圖11)。所有這些接受西妥昔單抗治療的患者在疾病進展前均保持RAS和EGFR野生型的狀態。
圖11、抗EGFR治療後出現多重耐藥突變的示例
討論
該研究針對 mCRC 患者在一線姑息治療期間連續採集的血液樣本進行NGS 測序，以全面分析縱向 ctDNA 監測在mCRC 患者中的臨床應用價值。90%的患者在治療前基線的 ctDNA 樣本中檢測到基因變異，不僅包括 SNV，還包括 CNV。治療後 ctDNA 的變化反映了腫瘤對治療藥物的反應（腫瘤縮小或再生長）。治療後的 ctDNA 清除能夠在相似影像學變化的患者中進一步區分出對治療反應更好的人群，並且早於影像學變化之前檢出新發耐藥變異的患者可早期預警腫瘤的進展風險。因此ctDNA 縱向監測可為mCRC 患者整個病程中的個性化治療決策提供可靠的信息。
與之前的報道一樣，該研究也證實了 ctDNA 可以有效地揭示治療後患者的腫瘤異質性和ctDNA動態變化。RAS 基因突變是目前 mCRC 治療選擇的最重要的生物標誌物之一，在11.0% 的本研究入組人群ctDNA樣本中檢測到該突變，這與之前的報道相似。在三名同時或依次患有多原發性腫瘤的患者中，如果沒有 ctDNA檢測，就不可能在未行活檢的轉移灶中確認發生哪些優勢克隆突變。已有很多研究提出腫瘤空間異質性是腫瘤患者產生不同治療反應的原因，這表明使用 ctDNA評估對於藥物選擇的重要性。此外，34.9% (15/43) 的患者在疾病進展時檢測的ctDNA突變譜與治療前基線不同。
通過評估ctDNA 突變丰度的變化也可以預測治療反應。儘管在開始治療後的第一次評估中，除一名患者外的其他所有患者（98.0%）均檢測到突變的 VAF 下降，但化療後的 ctDNA 清除可預測更長的 PFS。ctDNA 清除可以進一步區分 RECIST 1.1 相同治療反應分類下的患者，為傳統的影像學評估提供了額外的信息。在該研究中顯示，如果達到ctDNA 清除，還能持續ctDNA清除，則在PR 患者會有甚至更長的 PFS，這表明 ctDNA 可以敏感地反映治療期間癌症的動態變化。關於預測治療反應的精確 ctDNA 評估策略仍然存在爭議，在未來的研究中還應考慮更實際的應用策略，例如結合 ddPCR 和 NGS 方法以降低縱向監測的成本。
ctDNA（尤其是基於 NGS 的方法）檢測的準確度是非常重要的問題。不僅要關注敏感性，測序錯誤或非腫瘤相關的突變假陽性風險也值得關注。在該研究的所有患者中，90.3% 的患者檢測到ctDNA突變，略高於其他研究。在患者血液中可檢測到的 ctDNA突變，有高達 87%是可通過組織測序鑑定出的。雖然研究者做了很多努力，但仍有一部分轉移性疾病患者無法檢測到ctDNA 突變。血液樣本中 ctDNA 突變的檢測可能受到各種因素的影響，例如患者的腫瘤負荷或轉移狀態、樣本採集和製備的質量以及測序技術的能力。然而，即使在最佳實驗條件下，不可否認的是仍有一小部分腫瘤患者的ctDNA 釋放量較少，這可能是由於腫瘤的固有性質決定的，如解剖位置、腫瘤血液供應或血管生成的差異，或其他尚待闡明的生物學因素。在 mCRC 中，似乎除肝以外的轉移病灶釋放到血液循環中的 ctDNA 明顯少於肝病灶，與之前的研究結果一樣，需要進一步深入研究了解 ctDNA 的生物學特性。因此，在臨床中解釋 ctDNA的檢測結果時，應考慮其局限性，特別是在腹膜種植轉移患者中。
為了降低假陽性，研究者用 PBMC 測序數據過濾掉 CHIP 以及胚系突變，並且對於反覆出現的類噪音突變「黑名單」進行額外過濾後，能夠保證鑑別出較低 VAF 的突變。然而，即使在這樣的情況下，仍然可檢測到低VAF值、未知臨床意義的新發突變，特別是優勢克隆已被清除或顯著減少的治療後。關於這些突變是亞克隆還是假陽性，目前還無法從該研究中得出結論。將來進一步改進分析流程，如選擇片段大小選擇和積累更多與臨床信息相關的 ctDNA 測序數據，可能有助於提高數據準確性。
這項研究有幾個局限性。首先，研究隊列的患者均為醫生個體自行選擇的接受第一次姑息治療的mCRC 患者，因此臨床環境和治療決策各不相同，導致不同臨床方案中的患者入組數量較少。其次，研究者並不計劃在患者化療開始後立即收集樣本。因此，在治療四個周期後的第一個評估時間點，62.7% (32/51) 的患者 ctDNA 已經清除，無法確定最佳評估時間點或早期清除對治療反應和患者生存期的影響。然而，在本研究第一次評估時的 ctDNA 清除仍然可以將不同治療反應的人群區分開來，在該時間點之後又有15.8% (6/38) 的患者ctDNA 清除。此外，有報道稱，如果在開始治療後過早評估，則 ctDNA 變化的預測能力可能會受限。總之，通過腫瘤ctDNA分析和縱向 ctDNA 監測可以可靠地指導癌症患者的臨床治療決策。