根據2021年世界衛生組織中樞神經系統腫瘤分類（WHO CNS5），準確檢測分子變異，如單鹼基替換（IDH1/2，TERT）、染色體變異（CDKN2A、1p/19q缺失和EGFR擴增）或啟動子甲基化（MGMT），對於腦膠質瘤患者的管理至關重要。本研究的目的是在WHO CNS5背景下，評估檢測IDH1/2狀態的新方法。
使用NGS對34例膠質瘤樣本同時進行了多個生物標誌物檢測。如果IHC或MLPA檢測IDH1/2狀態結果與NGS不一致，則進行qPCR和Sanger測序來解決判定差異。結果顯示，IDH1/2 NGS檢測結果與IHC（7/13樣本）和MLPA（1/4樣本）不同。qPCR和Sanger測序證實了所有NGS檢測結果。WHO CNS5建議檢測多個變異用於膠質瘤分類。本研究表明，qPCR或NGS檢測IDH1/2比IHC更可靠。臨床醫生應注意MLPA或IHC檢測結果的差異，可利用先進分子技術再次進行驗證。此外，本研究基於WHO CNS5，提出了一種神經膠質瘤患者分子診斷新規範。
研究背景
膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統（CNS）腫瘤，發病率為1.9-9.6/10萬，取決於年齡、性別、種族和地理位置。2021年世界衛生組織中樞神經系統腫瘤分類（WHO CNS5）從根本上改變了膠質瘤分類，納入了許多分子標誌物。在這個分類系統中，膠質瘤的主要分子標誌物是IDH1/2突變、1p/19q共缺失、H3F3A突變、ATRX突變、MGMT啟動子甲基化、CDKN2A缺失、EGFR擴增、7號染色體獲得伴10號染色體缺失，以及TERT啟動子致病性變異。根據新的分類，在成人型IDH野生型瀰漫性星形細胞瘤中，如果存在TERT啟動子突變、EGFR擴增、7號染色體獲得伴10號染色體缺失（+7/-10）這三個分子指標中的一個或多個，則診斷為膠質母細胞瘤（見圖1）。
圖1. 根據WHO CNS5 2021，基於分子特徵的星形細胞瘤分級。在IDH突變型星形細胞瘤中，CDKN2A純合缺失，是惡性級別最高的標誌物。在IDH野生型瀰漫性星形細胞瘤中，如果存在TERT啟動子突變、EGFR擴增、7號染色體獲得伴10號染色體缺失（+7/-10）這三個分子指標中的一個或多個，則為WHO CNS5最高級，歸為膠質母細胞瘤。目前分類中不存在IDH突變型膠質母細胞瘤。
根據分子特徵，可以使用多種分子檢測方法，例如螢光原位雜交（FISH），定量聚合酶鏈反應（qPCR）包括甲基化特異性聚合酶鏈式反應（MS-PCR），以及包括拷貝數變異（CNV）的NGS檢測。分子技術的解析度、靈敏度和特異性各不相同。NGS和qPCR的檢測下限（LOD）取決於流程和基因變異的類型。通常，qPCR的LOD在1%到5%之間，NGS在5%到10%之間；不過，NGS和qPCR的LOD不完全一致，通常分別在1%到10%和2%到15%之間變化。Sanger測序可以檢測頻率在15-20%及以上的基因變異。選擇合適的方法進行分子檢測非常重要。免疫組化（IHC）利用突變特異性單克隆抗體檢測突變蛋白，已被納入IDH1/2點突變標準篩查方法。儘管NGS檢測單個樣本的成本顯著高於其他方法，但由於NGS能夠實現全面檢測，在不久的將來，包括CNV的NGS將取代FISH、qPCR、Sanger測序或IHC等方法。
考慮到最新的診斷建議，以及臨床管理中分子標誌物越來越多，也越來越重要，本研究探索了NGS是否為能夠同時檢測膠質瘤多個分子標誌物的主要方法。此外，比較了NGS和IHC檢測IDH1/2狀態的情況（根據WHO CNS5）。
研究方法
對2017年1月至2021年6月期間到比得哥什癌症中心就診的86例膠質瘤病例進行了回顧性分析。患者在外院進行了組織病理學檢查和IHC檢測，沒有進行膠質瘤NGS檢測。年齡、性別、既往放化療治療史以及分子檢測結果等數據來自我中心。對34名患者的樣本進行了NGS檢測。NGS檢測納入標準為：診斷為膠質瘤的患者；組織樣本（與用於組織病理學檢查的相同）質量合格。排除標準如下：缺乏組織樣本或雙鏈DNA（dsDNA）的質量和數量不足以進行NGS檢測。在進行NGS檢測的34例膠質瘤中，17例先前在外院使用IHC或多重連接依賴性探針擴增（MLPA）檢測了IDH1/2狀態（圖2）。
圖2. 流程
樣本腫瘤細胞含量為5%到95%。從福馬林固定石蠟包埋（FFPE）腦腫瘤組織樣本中提取了DNA。使用實時聚合酶鏈反應（PCR）片段定量分析（FQA）CE-IVD和/或螢光法評估了DNA的質量和數量。
NGS panel（CE-IVD）覆蓋16個基因的熱點區域：BRAF、EGFR、ERBB2、HRAS、C-KIT、IDH1、IDH2、JAK2、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、RET、TERT啟動子區域以及TP53整個外顯子。
對所有IHC或MLPA檢測了IDH1/2狀態的樣本進行了qPCR和Sanger測序，以解決不同方法之間的判定差異，確定IDH1/2基因分型。
通過NGS檢測了拷貝數變異，看是否存在CDKN2A純合缺失。
研究結果
致病性和疑似致病性變異發生頻率
使用從34例膠質瘤患者樣本中提取的DNA進行了NGS檢測。TERT啟動子致病性變異發生頻率最高（23/34，67.6%），19/23存在NC_000005.9:g.1295228G>A（通常稱為C228T），4/23存在NC_000005.9:g.1295250G>A（C250T）。C250T和C228T變異相互排斥。TERT啟動子致病性變異在少突膠質細胞瘤中發生頻率最高（4/5，80%），其次是膠質母細胞瘤（13/18，72%）。IDH1/2致病性變異發生頻率第二高（13/34，38.2%），其次是TP53致病性變異（11/34，32.3%）和PIK3CA致病性變異（3/34，8.8%）（見圖3）。圖4顯示了共同存在的致病性變異。可以注意到，EGFR致病性變異在任何情況下都不會與IDH1/2致病性變異共存。此外，IDH1/2致病性變異體通常與TP53致病性變異共存。NGS檢測到的最常見的致病性變異示例見圖5。
圖3. 膠質瘤基因變異頻譜和患者臨床特徵
圖4. 患者共突變情況
圖5. NGS檢測到的最常見的致病性變
比較IHC或MLPA與NGS、qPCR、Sanger測序檢測IDH1/2狀態
先前外院使用IHC檢測了13例患者樣本的IDH1/2狀態，使用MLPA檢測了4例。外院用於IHC或MLPA檢測的相同FFPE樣本用於我院NGS檢測。
根據外院IHC檢測報告，4個樣本被歸為IDH野生型，而NGS檢出致病性變異。此外，3個樣本被歸為IDH突變型，但NGS未檢出致病性變異（表1）。報告沒有具體說明IHC檢測使用的抗體類型，也沒有說明是否為CEIVD抗體。而MLPA檢測的4個樣本中，1個樣本檢測結果與NGS不一致，MPLA顯示IDH野生型，而NGS顯示致病性變異。
表1. 外院（IHC）與我中心（NGS、qPCR、Sanger）IDH1檢測結果
由於IDH1/2 NGS檢測結果與IHC（7/13）和MLPA（1/4）不同，使用了兩種獨立的方法驗證NGS檢測結果：qPCR和Sanger測序。首先，使用了IDH1/2突變檢測試劑盒（CE-IVD），該試劑盒可檢測8個IDH1和9個IDH2變異。其次，Sanger測序使用的是同一組引物，但基因分析儀更新了。NGS、qPCR和Sanger測序的LOD分別為5%、1%和20%，將NGS檢測結果同34個qPCR樣本和31個Sanger測序樣本檢測結果進行了比較，顯示100%的一致性、100%的特異性和100%的靈敏度。3個樣本由於DNA嚴重降解，質量不佳，缺少擴增模板，無法進行Sanger測序來確定IDH1/2狀態。不過這3個樣本通過了qPCR的內部質控，qPCR檢測結果與NGS一致。
此外，將4例患者MLPA報告結果同NGS、qPCR和Sanger測序結果進行了比較。由於MLPA檢測的突變範圍有限（R132C、R132H、R172K和R172M），不包括R132L突變，1例是假陰性結果。
MLPA檢測試劑盒檢測IDH1/2變異數量有限，導致與NGS的一致性為75%，靈敏度為66.6%，特異性為100%。然而，這些結果並不具有代表性，因為MLPA樣本數量有限（只有4例患者；表2）。
表2. 外院（MLPA）與我中心（NGS、qPCR、Sanger）IDH1檢測結果
IHC檢測結果與NGS的一致性僅為38.5%，靈敏度為33.3%，特異性為42.9%。由於樣本數量有限，且報告來自不同的地方，靈敏度和特異性不能充分反映IHC方法的可靠性（圖6）。
圖6. 外院IHC、MLPA與我中心NGS、qPCR、Sanger檢測結果比較。IHC和MLPA有2例假陽性結果，IHC有1例假陰性結果。
基於WHO CNS5重新評估診斷
考慮到分子標誌物的作用越來越大，以及WHO CNS5的診斷建議，可進行NGS和FISH檢測，來重新評估診斷。
使用NGS，在所有（3/3）WHO 3級IDH野生型膠質瘤患者中檢出了TERT啟動子致病性變異。新的WHO CNS5分類建議將這些患者歸為4級膠質瘤，而不是3級（見表3）。對攜帶IDH1/2致病性變異的2級（A2）或3級星形細胞瘤（A3）患者的樣本進行了CDKN2A檢測。
表3. 基於NGS檢測結果和WHO CNS5 2021新分類的診斷變化
由於2個檢測樣本均未顯示純合缺失，因此這2個膠質瘤患者無需調整分類（圖7）。從WHO 2級到4級的變化對治療和隨訪方案非常重要。然而，本研究沒有攜帶TERT啟動子突變的IDH野生型2級膠質瘤患者。
圖7. FISH和NGS CNV檢測膠質瘤CDKN2A純合缺失
討 論
NGS相比IHC或MLPA的優勢
IDH1/2狀態可以通過多種方法檢測。十年前，我們團隊使用各種技術，包括IHC和分子基因檢測（PCR，Sanger），研究了IDH1/2的預後價值。這些年來，大多數實驗室已將IHC、焦磷酸測序、qPCR或MLPA作為膠質瘤常規診斷方法。在本研究中，我們使用NGS檢測了所有已知和新的變異，並同IHC、Taqman特異性探針（qPCR）、雜交（MLPA）和Sanger測序進行了比較。在評估來自外院的IDH（IHC或MLPA）報告時，我們發現了臨床上顯著的不一致，對WHO分類和治療有影響。進行了NGS檢測，發現IHC和MLPA結果分別有7/13和1/4與NGS不同。為了更好地了解這些差異對臨床決策的影響，進行了qPCR和Sanger測序，結果證實了所有基於NGS的診斷。
值得注意的是，非典型IDH突變在幕下星形細胞瘤中發生率為80%，在幕上星形細胞瘤中為10%。對此，可使用IHC、MLPA或qPCR進行篩查，陰性結果需要重新進行NGS檢測。本研究中，有一名患者攜帶非典型突變，所以IHC沒有檢出。
研究發現，13個外院IHC檢測結果中，有7個IDH1/2狀態錯誤分類。雖然立體定向活檢經常用於腦腫瘤診斷，但只能獲取少量組織。這可能會影響IHC檢測，導致假陰性結果。此外，組織（手術或立體定向活檢）檢測前的標準化處理，組織病理學染色和IHC在醫院極難實施。因此，IHC檢測中的人為因素及組織固定包埋的挑戰降低了IHC檢測的靈敏度，增加了數據分析的難度。相比之下，在NGS、Sanger測序和qPCR中，DNA被擴增，從而樣本腫瘤組織較少也能檢出變異。這解釋了為什麼檢測結果不一致。3個樣本IHC顯示IDH野生型，而NGS和qPCR檢測到IDH1/2基因突變。
考慮到目前的2021 WHO分類建議檢測多個基因變異，臨床應用應基於高通量技術檢測，例如膠質瘤中使用NGS，而不是耗時的級聯診斷。此外，IHC、Sanger測序、PCR或FISH（用於檢測IDH1/2、TERT、EGFR、CDKN2A和1p19q多種體細胞變異）等不同常規技術檢測的總成本可能比單個NGS檢測成本更高。
成人型星形細胞瘤患者的綜合跨學科診斷規範
多年來，分子技術有了顯著的發展。因此，納入了分子指標用於更精確的膠質瘤分級和預後評估。2016年，WHO CNS分類首次使用分子標誌物對膠質瘤進行分類，2021年，更加重視生物標誌物。由於WHO CNS5是近期發表的，目前還沒有文獻描述星形細胞瘤的分子診斷標準。為了滿足這一需求，我們提出了以下基於NGS檢測結果的診斷規範（圖8）。
圖8. 星形細胞瘤患者綜合跨學科診斷規範
診斷腦腫瘤的第一步是在手術過程中獲得可靠的組織。當顯微手術切除不可行時，應進行立體定向活檢，因為它安全、有效，並且獲取的診斷組織與開放手術樣本高度一致。根據CNS5 2021分類，獲取具有代表性的樣本用於組織學和分子檢測非常重要。其次，IDH基因狀態檢測似乎是星形細胞瘤患者治療的關鍵步驟。基於IDH1/2基因檢測和組織病理學檢測結果，應確定進一步分子診斷的方向。診斷星形細胞瘤患者時，應首先進行組織病理學分級評估，尤其是將4級膠質瘤（存在壞死和微血管增生）與2級或3級膠質瘤區分開來。對於2級和3級星形細胞瘤，我們建議將NGS作為首選方法。檢測應覆蓋儘可能多的膠質瘤生物標誌物。NGS panel必須覆蓋IDH1/2、TERT，可以額外檢測PIK3CA和TP53，但不是必須。我們還建議通過NGS檢測CDKN2A、EGFR和+7/-10染色體CNV。如果NGS panel不包括CNV，則必須通過FISH對IDH突變型星形細胞瘤進行檢測，以確定是否存在CDKN2A純合缺失或EGFR擴增。
另一方面，在IDH野生型星形細胞瘤中，進一步的治療取決於TERT啟動子致病性變異和EGFR擴增。因此，通過NGS同時檢測IDH1/2、TERT啟動子和EGFR擴增，能夠快速準確地對患者進行2021 CNS5分類。如果先前被歸為IDH野生型星形細胞瘤患者檢出TERT或EGFR變異，則應診斷為IDH野生型膠質母細胞瘤。如果沒有檢出TERT啟動子致病性變異和EGFR擴增，則需要檢測是否存在+7/−10染色體變異。既可以用涵蓋CNV的NGS檢測，也可以單獨進行FISH檢測。如果檢出+7/−10染色體變異，則診斷為IDH野生型膠質母細胞瘤；如果未檢出，則診斷為IDH野生型星形細胞瘤。對於4級星形細胞瘤，僅確定是否存在IDH基因突變就足夠了。如果檢出突變，WHO CNS5建議將其歸為IDH突變型4級星形細胞瘤；如果沒有檢出突變，需要診斷是否為IDH野生型膠質母細胞瘤。
可以額外檢測預後和預測生物標誌物，例如MGMT甲基化，特別是在IDH野生型和A4 IDH突變型膠質母細胞瘤中。最後，將組織病理學和分子檢測結果結合起來，可以做出可靠而準確的診斷，從而實現精準治療。
雖然WHO CNS5僅建議4級膠質瘤患者檢測IDH基因，但我們建議進行NGS檢測，使用覆蓋星形細胞瘤中最重要和突變頻率最高的基因（如IDH1/2、TERT、EGFR、TP53和PIK3CA）panel。這樣診斷不僅可以基於組織學特徵（壞死和血管浸潤），還可以基於分子變異（WHO CNS5納入的與生存期較短相關的變異）。因此，使用NGS檢測多個基因可以使預後評估更加準確。
根據在WHO CNS5之前發布的歐洲神經腫瘤學協會（EANO）指南，如果IHC檢測結果為IDH野生型，則需要進行IDH分子檢測。值得注意的是，這些IHC指南是在WHO CNS5納入完整的新型分子生物標誌物列表之前制定的。因此，應修改這些建議，納入NGS，可以一次性檢測多個指標。因此，如果需要檢測多個生物標誌物，來對膠質瘤準確分類，應一開始就進行全面檢測，尤其是當樣本量有限時。
總之，推薦NGS檢測。第一，檢測IDH狀態，本研究表明，該方法結果更可靠；第二，可以檢測多個生物標誌物。FISH通常用於檢測CDKN2A純合缺失，+7/−10或EGFR擴增，預計將在不久的將來會被NGS CNV取代。
局限性
本研究有幾個局限性。沒有關於每名患者IDH1/2檢測方法的信息，因為是在12個不同的地方進行的檢測。由於組織病理學檢查報告沒有說明IHC抗體的類型，無法確定哪種特定抗體導致假陽性和假陰性結果。此外，僅對34個膠質瘤樣本進行了NGS檢測，因為只有這些樣本符合質量標準。使用的是成人膠質瘤16基因NGS panel ，和84基因NGS CNV panel。沒有關注FGFR、NTRK基因家族、NF1或H3 H3F3A，這些也是必要的關注點，特別是對於兒童膠質瘤分類。
可依據組織病理學結合分子檢測結果進行精確的診斷，從而實現精準治療。本研究表明，NGS作為一種新的方法可以完善膠質瘤分子檢測結果，提高分類準確性，尤其是星形細胞瘤。WHO CNS5指南表明了結合組織病理學和分子檢測結果對惡性膠質瘤進行分類的重要性，應將腫瘤組織學亞型和分級與各種分子生物標誌物結合起來，如基因突變和CNVs。此外，本研究提出了一種基於WHO CNS5的膠質瘤患者NGS分子檢測新規範。
參考文獻：
Śledzińska P, Bebyn M, Szczerba E, Furtak J, Harat M, Olszewska N, Kamińska K, Kowalewski J, Lewandowska MA. Glioma 2021 WHO Classification: The Superiority of NGS Over IHC in Routine Diagnostics. Mol Diagn Ther. 2022 Sep 2. doi: 10.1007/s40291-022-00612-3. Epub ahead of print. PMID: 36053463.