「我們開創了受激拉曼光熱成像[1]這個全新的方向，這是化學成像領域的一個新突破，這項技術未來一定會發展成為能夠被廣泛應用的產品。」美國波士頓大學程繼新教授如是說。
圖丨程繼新（來源：程繼新）
在這次研究中，程繼新團隊利用一種新的物理機制，即受激拉曼本質上是一個化學鍵振動吸收過程，吸收的能量變成熱形成焦點局部升溫，升溫改變焦點周圍樣品的折射率。由此，他們開發出受激拉曼光熱（Stimulated Raman Photothermal，SRP）顯微鏡。
該技術突破了此前受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering，SRS）成像的檢測極限，將調製深度提高了 500 倍，極高的調製深度為更高靈敏度的檢測奠定了基礎。
那麼，與 SRS 相比，SRP 有哪些不同呢？具體來說，SRS 顯微鏡直接測量光被吸收後強度的變化，並提供光譜和空間信息；而 SRP 顯微鏡則是測量由樣品熱膨脹引起的光散射或由熱透鏡引起的折射，觀察樣品本身的溫度、折射率等變化，進而提供光譜和空間信息。
化學成像技術能夠「追蹤」細胞中的分子信息，但該領域最大的瓶頸之一是靈敏度。SRS 顯微鏡在揭示複雜系統中的分子結構、動力學和耦合方面顯示出巨大的潛力。然而，由於其較小的調製深度和脈衝雷射的散粒噪聲，SRS 的靈敏度難以突破毫摩爾級，這導致其無法對低濃度分子的觀察及對相關信息的追蹤。
此外，不可忽視的是，在使用 SRS 成像時，研究人員必須使用高倍物鏡來收集信號。如果想得到高分辨成像，就必須將兩個高倍物鏡擠在一起，這在操作上帶來極大的不便。而 SRP 的優勢在於操作簡單、方便，只需要低倍物鏡就能夠測量相關信號，且檢測物鏡和樣品之間可以保持一定的距離。
由於 SRP 顯微鏡非常靈敏，可以通過它觀測不同的分子、不同的化學鍵，填補了該領域的數據空白。該技術有望應用於環境科學、材料科學、生命科學等領域，例如環境中微塑料檢測、繪畫作品成分分析、病毒單顆粒譜學、單細胞和生物組織成像等。
一次「因禍得福」的聚會開啟了一個新方向
該技術背後的科研故事要從一次「因禍得福」的聚會說起。2021 年，在程繼新 50 歲生日時，舉辦了一次課題組聚會，其中的主題之一是籃球比賽。組內成員博士研究生朱一凡在運動時不小心受傷了，因此需要在家休養 2 個月。
於是，程教授交給他一個計算方面的任務：在受激拉曼散射成像時，聚焦焦點的溫度變化具體是多少？
根據朱一凡的模擬結果，在大概 10 微秒的時間裡，相關溫度上升了 2 至 3 攝氏度，這個結果很快引起了程教授的高度關注。「這個範圍的瞬態溫度變化不會損害細胞。於是，我們開始探索拉曼效應用於光熱顯微鏡這個全新的方向。」程繼新說。
圖丨SRP 顯微鏡設計（來源：Science Advances）
從計算方面確定了溫度升高的數據，那麼，如何在實驗上證實溫度升高呢？研究人員想到，可以用對溫度很敏感的螢光染料來做溫度計。具體來說，把螢光染料加入樣品，在受激拉曼激發的同時進行螢光測量。實驗結果證明螢光強度呈下降趨勢，以此在實驗上確認了受激拉曼導致的溫度升高（如下圖）。
圖丨受激拉曼光熱效應的理論模擬和實驗觀察（來源：Science Advances）
但是，螢光測試是有標記的測量，而他們更想通過無標記（label-free）的方式測量光熱信號。於是，研究人員用「第三束光」測折射率的變化，可以在純液體中得到同樣的信息，而且這種做法不受脈衝雷射噪音的影響。最終，他們突破了此前 SRS 成像的檢測極限，將調製深度提高 500 倍。
組內成員博士研究生殷嘉澤以中紅外光熱顯微鏡（Mid-infrared photothermal microscopy）為主要研究方向，於 2021 年發展了一種新方法，用快速模數轉換直接提取光熱信號[2]。該方法同樣適用於 SRP 顯微鏡，從而有效地提高了其檢測靈敏度。
圖丨生物樣品在水溶液環境中的 SRP 成像（來源：Science Advances）
此外，組內成員博士研究生戈孝偉為本次開發 SRP 顯微鏡提供了 SRS 的實驗基礎。由此可見，研究是一個逐漸積累的過程，並需要團隊成員發揮各自的優勢，這充分體現了「眾人能移萬座山」的精神。
圖 丨相關論文（來源：Science Advances）
近日，相關論文以《受激拉曼光熱顯微鏡實現超靈敏化學成像》（Stimulated Raman photothermal microscopy toward ultrasensitive chemical imaging）為題發表在 Science Advances [1]。波士頓大學博士研究生朱一凡為該論文第一作者，程繼新教授為論文通訊作者。
16 年磨一劍
1999 年，程繼新在香港科技大學從事第一個博士後研究，他選擇了一個技術較為成熟的研究方向——超快光譜學（ultrafast spectroscopy）。同年，諾貝爾化學獎頒予飛秒時間分辨的超快光譜學技術。
2000 年，他加入國際單分子生物物理化學的奠基人之一、哈佛大學謝曉亮教授（現北京大學李兆基講席教授）課題組，從事第二個博士後研究。在那裡，程繼新和其他同事開發了可實現高速振動光譜成像的相干反斯托克斯拉曼散射（coherent anti-Stokes Raman scattering，CARS）顯微鏡。
2014 年，諾貝爾化學獎頒予超解析度螢光顯微技術。但是，螢光顯微鏡不能解決生物成像領域中所有的問題，例如，螢光染料標記會改變膽固醇、胺基酸等小分子的生物功能。因此，生命科學需要無螢光染料標記的分子成像技術。程繼新表示，「選鍵成像很好地解決了分子選擇性的問題，其不僅能看到各種分子，又不需要對分子進行螢光染料標記。」
夢想很美好，現實卻充滿挑戰。能不能通過發明新技術，去做螢光顯微鏡做不到事情？「繼新」人如其名，從學生時代就喜歡啃「硬骨頭」的他，繼續探索。
博士後研究工作結束後，程繼新於 2003 年來到美國普渡大學任教，在那裡，他將分子光譜學與生物醫學工程融合，致力於化學成像這一新興領域。
2007 年，該課題組報道了一個有趣的發現：由於受激拉曼增益和損耗，一部分能量從光子轉移到分子[3]。因為脈衝式的能量吸收可以產生聲波，該發現促使其團隊開發出受激拉曼光聲顯微鏡（stimulated Raman photoacoustic microscope）。
然而，由於當時的光聲測量不是很靈敏，他們沒測到受激拉曼光聲信號。幸運的是，在一個意外的實驗中，他們發現了基於泛頻激發的光聲信號[4]，並開發了檢測血管內壁膽固醇的振動光聲內窺鏡。
圖丨中紅外光熱選鍵成像的原理（左）及產品展示圖（右）（來源：程繼新）
為尋找增強化學鍵成像信號的方法，他們再次調整研究方向。通過「thinking out of the Raman box」，開啟了中紅外高分辨光熱成像這一全新的方向。由於分子振動吸收的能量在皮秒的時間尺度上全部轉化為熱能，程繼新意識到，光熱效應可以用來「看」細胞里的化學鍵。
2016 年，他們報道了高靈敏度中紅外光熱顯微鏡 (Mid-infrared photothermal microscope)，突破性地實現中紅外超分辨三維動態成像。通過用可見光來測量光熱效應，該技術能夠以亞微米解析度「看見」活細胞中的化學組分，首次使單細胞紅外顯微成像成為可能[5]。
2017 年，程繼新加入波士頓大學擔任光學中心的 Moustakas 光學及光電子學講席教授。他的團隊致力於精準醫學光子學技術的研發，研究覆蓋了化學成像、神經調控、光學殺菌等三個方向。
其課題組在全球首次通過光聲信號來刺激、調節神經細胞（如下圖）。最近，他們設計了一種用於無創神經刺激的高精度（0.1 毫米）光致超聲器件，並在小鼠模型成功驗證，第一次利用非遺傳途徑進行超高精度的無創神經調節[6]。此外，他們還發明了一種通過光解色素來殺死抗藥性超級細菌的方法[7]。
圖丨光致超聲神經刺激工作原理圖和橫向聲場壓強分布（來源：程繼新）
程繼新認為，真正原創的工作不是被設計出來的，而是實現了從來沒想過會發生的事情。「原創的科學是由直覺推動的，並得益於長期不懈的努力和積累，所謂的『突破』其實是一個量變到質變的過程。」他總結道。
不止於科學技術的創新，在推進技術產業化落地的過程中，更是讓他感嘆「應用範圍超乎了最初的想像」。據悉，程繼新擁有 30 多項國際專利，並作為聯合創始人或科學顧問參與了多項技術的產業化。
2015 年，基於分子振動光聲技術，程教授和學生們共同創立了 Vibronix Inc.，該公司致力于振動成像技術研發和醫療設備創新，現位於蘇州工業園區。2018 年，作為科學顧問參與建立了光熱光譜公司（Photothermal Spectroscopy Corp.）。該公司位於美國加州，基於程教授的中紅外光熱成像專利開發了一款名為「海市蜃樓（mIRage）」的顯微鏡，寓意為「信號來自於折射率的變化」。據了解，該產品目前已銷往世界各地百餘實驗室。
2019 年，程繼新聯合創立了 Pulsethera 公司，旨在通過內源發色團的光解作用殺死超級細菌。2022 年，程繼新成為法國巴黎 AXORUS 公司的科學顧問，該公司致力於光聲神經刺激技術的醫學轉化。
談及技術的推進產業化落地的經驗，程繼新表示，在發展某項技術時，可能最開始只聚焦在生命科學領域的某個細分方向，但將技術真正發展為產品，其應用範圍之廣可能是當初沒有想到的。
他舉例說道：「mIRage 現在被應用在半導體領域，用來檢測晶片中的污染。晶片中的污染多數是有機物，因此能夠通過化學鍵成像來檢測晶片的質量，這完全超乎了我的想像。」
（來源：程繼新）
回顧三十年的科研之路，程繼新認為，最有回味的事情是每個階段都有新驚喜。化學成像領域每經過大約 8 年就要進行一次技術革新，從 1999 年的 CARS 顯微鏡到 2008 年的 SRS 顯微鏡，到 2016 年的中紅外高分辨光熱成像，再到 2023 年的 SRP 技術。「幾年前還覺得是天方夜譚的事情，都通過發明新的技術實現了，由此一步步將領域發展向前推進。」程繼新說。
下一步，該團隊將繼續發展無螢光標記的化學成像，進一步提升靈敏度，同時發展深組織的高分辨化學成像技術。他們希望，能夠利用高能量的雷射器將 SRP 的靈敏度提升到接近於螢光顯微鏡的微摩爾級別。同時，他們計劃儘快將該技術發展為產品。據悉，美國加州的Photothermal Spectroscopy Corp.及中國蘇州的威邦震電公司（Vibronix Inc.）正在推進相關的產業化進程。
從 2007 年觀測到受激拉曼過程的能量轉移，到 2023 年報道 SRP 顯微鏡，對程繼新來說，這是一次歷經 16 年的科研旅程。在本次的 SRP 論文發表後，他在朋友圈這樣寫道：「科學很酷，生命短暫。我的下一個 16 年會是什麼樣呢？」
參考資料：
1. Zhu，Y., et al. Stimulated Raman photothermal microscopy toward ultrasensitive chemical imaging. Science Advances9, eadi2181 (2023). https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adi2181
2. Yin, J., et al. Nanosecond-resolution photothermal dynamic imaging via MHZ digitization and match filtering, Nature Communications, 12, 7079 (2021). https://www.nature.com/articles/s41467-021-27362-w
3. Wang, H., et al. Experimental observation and theoretical analysis of Raman resonance-enhanced photodamage in coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Journal of the Optical Society of America B, 24, 3, 544-552 (2007). https://opg.optica.org/josab/abstract.cfm?uri=josab-24-3-544
4. Wang H., et al. Label-Free Bond-Selective Imaging by Listening to Vibrationally Excited Molecules. Physical Review Letters, 106, 238106 (2011). https://journals.aps.org/prl/abstract/10.1103/PhysRevLett.106.238106
5. Zhang, D., et al. Depth-resolved mid-infrared photothermal imaging of living cells and organisms with submicrometer spatial resolution, Science Advances 2, e1600521 (2016). https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.1600521
6. Li, Y., et al. Optically-generated focused ultrasound for noninvasive brain stimulation with ultrahigh precision. Light: Science & Applications 11, 321 (2022). https://www.nature.com/articles/s41377-022-01004-2
7. Dong P, et al. Photolysis of Staphyloxanthin in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Potentiates Killing by Reactive Oxygen Species. Advanced Science, 6, 1900030 (2019). https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.201900030