王開樂，是美國德克薩斯大學安德森癌症中心的助理教授。近日，他和合作者研發一款高通量單細胞 DNA 測序方法——「Arc-well」。
圖 | 王開樂（來源：王開樂）
這是第一個能對福馬林固定石蠟包埋（FFPE，Formalin-Fixed Paraffin-Embedded）組織進行測序的方法，能同時對數千個細胞進行基因拷貝數進行分析，填補了利用單細胞 DNA 測序對 FFPE 樣本進行大規模基因組分析的空白，使得存放幾十年的 FFPE 樣本得以重見天日。
藉助這一方法，該團隊針對原發原位導管乳腺癌（DCIS，ductal carcinoma in situ）和復發 DCIS 和浸潤性乳腺癌樣本進行系統性研究，藉此揭示了從原發 DCIS 到復發癌症所遵循的演化模型，為治療原發 DCIS 提供了重要參考。
從技術層面來講，Arc-well 方法不僅適用於乳腺癌樣本，也適用於其他癌症。該團隊利用 Arc-well 對肺癌、前列腺癌、結腸癌、食道癌、卵巢癌等其他多種癌症進行了單細胞 DNA 測序，都獲得了非常穩定可靠的結果。
儘管 Arc-well 方法主要針對 FFPE 樣本，但其同樣適用於新鮮組織和冰凍組織。在新鮮組織和冰凍組織中，由於 DNA 保存得更好、更完整，因此還能檢測這些樣本中所存在的 DNA 點突變和小的插入缺失等。
當然，Arc-well 也可用於其他不同物種之中，比如常見的模式生物小鼠、大鼠、靈長類等等。經過一定優化，Arc-well 也可以在植物和海洋生物上產生巨大應用前景。另外，還可嘗試用於研究博物館中存放幾十年甚至上百年的動物組織樣本。
整體來看，在乳腺癌治療層面，本方法鑑定了來源於原發癌症之中的殘留克隆，並發現了可能和乳腺癌復發相關的一系列基因組變異事件。這說明在特定的樣本之中，原發性的癌症克隆並沒有被手術徹底清除掉。對於這類患者來說，還需要結合其他治療方案加以進一步處理。
而此次鑑定的和復發相關的基因組事件，也可作為相關治療方案的參考靶點。同時，也能為研究乳腺癌復發提供目標和思路。另外，同樣的思路也可用來研究其他癌症的原發、復發和轉移等。
（來源：Cell）
分析 10 位病人的 20 個匹配樣本
DCIS 是侵潤性乳腺癌的常見前體，通常在乳腺 X 射線篩查期間被檢測到。在大約 20% 的患者中，即使經過手術和放療等局部治療，DCIS 也可能會在 15 年內復發或發展為侵潤性疾病。
然而，對於原發 DCIS 病變是否與復發的 DCIS 或侵潤性導管癌存在直接基因譜系關係？DCIS 的克隆多樣性及其如何演化為復發疾病？復發疾病中是否存在來源於原發 DCIS 的殘留癌細胞克隆？以及哪些基因或者拷貝數事件跟復發相關等這些關鍵問題仍然沒有很好的解決。
為解決這些問題，該課題組與荷蘭癌症研究中心、以及美國杜克大學的研究團隊合作，針對所收集的來自 10 位病人的原發 DCIS、以及來自 2-16 年後復發 DCIS 病人的 20 個樣本進行了 Arc-well 測序，藉此全面分析了 DCIS 樣本和復發樣本中基因拷貝數的變異情況。
他們發現原發 DCIS 樣本具有與復發樣本相當的基因組異質性，且絕大多數樣本已經經歷了全基因組倍增事件。進一步通過基因組譜系演化分析他們發現：在所有的 10 個樣本中，復發癌症都跟原發 DCIS 存在直接的譜系關係，且絕大多數復發樣本是由原發 DCIS 經歷演化瓶頸之後逐步發展而成，只有少數樣本經歷了多克隆演化的模型。同時，他們鑑定了與復發相關的基因組變異事件。
（來源：Cell）
聚焦於研究乳腺癌的演化和發展
乳腺癌的演化和發展，一直是王開樂所在實驗室的研究重點。早在 2016 年，該團隊就著手開發新一代單細胞 DNA 測序技術，並從最初的幾十個細胞做到幾百個細胞。
但是，如此低的通量對於研究 FFPE 的 DCIS 樣本是遠遠不夠的。因為 DCIS 是相對早期的乳腺癌，在這些癌症樣本之中存在大量的正常細胞，包含上皮細胞、基質細胞和免疫細胞等。而在這些二倍體細胞之中，很有可能含有少數基因組變異的癌細胞。因此，在對 DCIS 進行測序時，需要同時對來自二倍體和多倍體的細胞同時進行測序。
另外，由於樣本來源於 FFPE，因此在解離單細胞的過程中，會產生很多不完整的細胞。同時，由於樣本的長時間儲存，還會有大量 DNA 降解的細胞。
因此，只有高通量的、穩定性極高的單細胞測序方法，才能有效地對 FFPE 樣本進行基因組分析。
意識到這一問題之後，王開樂便著手開發 Arc-well。他從新鮮細胞系入手，從使用單個 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應）管進行手動測試，到使用超聲液體加樣儀對幾百個單細胞進行測試，最後使用納升體系開展晶片測試。
隨後，他們又測試了由福馬林固定的細胞系、新鮮製備的 FFPE 樣本、以及已被保存多年的 FFPE 樣本。期間，他們還測試了不同的 FFPE 單細胞解離方案和 FFPE 樣本修復方案等。
2019 年，該團隊完成了實驗方法的開發和優化。同年，他們開始和荷蘭癌症研究中心以及美國杜克大學的研究團隊合作，收集配對的原發 DCIS 和復髮乳腺癌樣本。一直到 2022 年初完成了所有的實驗、數據分析、以及論文的撰寫。
最終，相關論文以《存檔的單細胞基因組學揭示了 DCIS 進展過程中的殘留亞克隆》（Archival single-cell genomics reveals persistent subclones during DCIS progression）為題發在 Cell[1]，王開樂是第一作者，美國德克薩斯大學安德森癌症中心尼古拉斯·E·納文（Nicholas E. Navin）擔任通訊作者。
圖 | 相關論文（來源：Cell）
Arc-well 使得對 FFPE 樣本進行高通量單細胞 DNA 測序成為可能，雖然該研究主要聚焦於拷貝數變異事件，但他們也在拓展該方法在 DNA 單鹼基突變檢測方面等的應用，並逐步提高這一方法的通量和解析度，以及降低該方法的成本。
同時他們正在對更大規模的乳腺癌原發和復發樣本進行單細胞測序，藉此確定跟復發相關的基因組變異事件。另外，針對存在於復發癌症中的、來源於原發 DCIS 的癌症克隆空間定位及其微環境，課題組也非常感興趣。
充滿人生變革，嘗遍酸甜苦辣
整個研究耗時將近 6 年，他說：「這 6 年，我在工作和生活上都經歷了很多事，可謂嘗遍了酸甜苦辣。」
工作上，他花了將近一年試圖重複他人方法來研究自己的課題，結果發現數據基本不可用，於是不得不放棄。而他自己設計的方法明明原理上行得通，但是嘗試了幾十上百次依然不成功。
他說：「明明簡單得不行，但在一開始就是怎麼也做不出來。後來發現原因之後，通過簡單的錯開時間就解決了問題。」
此外，他也曾為博後前幾年沒有任何產出而飽受折磨與煎熬。
幸運的是，他所設計的各種方法都開始慢慢有起色，實驗室成員之間也都能相互合作，最終讓論文得以順利發表。
其還表示：「期間我的生活也發生了巨大變化。我痛失了我摯愛的、曾給予我一切的、養我、教我的父親。自己也開始從之前的為人子變成了為人父。娃的到來，給工作和生活都帶了前所未有的挑戰，但也帶來許多幸福和美好的瞬間。儘管一路走來步履維艱，幸運的是一直有家人的支持。」
據介紹，王開樂是山東費縣人。他的父親是一名木匠，平時喜歡鑽研東西。受父親的薰陶，他也喜歡開發新方法和新東西。因此，在王開樂的絕大多數工作中，他都是通過開發新方法去解決有趣的生物學問題。
王開樂本科畢業於中南民族大學。他表示：「我考研還是蠻波折的，當時報考的第一單位只招收一人，最後輾轉調劑到中國科學院北京基因組所。那時我的導師吳仲義剛從芝加哥大學回國擔任基因組所所長，正好組裡有名額，我就有幸成為了吳老師的學生。」
他繼續說道：「可以說正是吳老師的收留改變了我的一生。吳老師是個非常純粹的科學家，對學生很是開放和寬容。他總是有很多有意思的科學問題，而當時最吸引我的就是檢測人體正常體細胞存在的突變。」
但是，由於當時高通量測序存在 0.1%-1% 的錯誤率，而正常人體中 DNA 突變的水平遠遠低於此，因此必須研發新的方法去解決這些難題。
從那開始，王開樂就踏上了低頻突變檢測之路。剛開始他設計了一種方法：利用 Tn5 轉座子將帶有分子標籤的序列，加入目標 DNA 分子兩端。結果由於當時的測序成本等問題，這一方法最終沒能成行。然而正是從此開始，他開始學習設計不同的分子生物學方法，也讓他找到了自己喜歡的方向。
後來，在中國農科院研究員阮珏老師的指導之下，他們提出了一種利用串聯重複體相互矯正來降低 DNA 測序錯誤的思路。通過這一方法他們獲得了比傳統方法高出兩個數量級的精準度。
王開樂說：「科學研究有時也伴隨著驚喜，我在讀博期間設計了一種雙切口的雙鏈環狀結構來控制 DNA 滾壞擴展的倍數。但是我做了很久都沒有任何進展。
就在臨近博士畢業時，我突然想明白關鍵所在，於是稍微修改下設計方案，結果一下就做成了。那種苦思而不得解、突然柳暗花明的感覺特別美妙。」
後來，他在博士畢業之後來到美國德克薩斯大學安德森癌症中心進行博士後研究。在這裡，他設計開發了一種可以對單細胞進行樣本和空間標記的方法，開發了本次論文提到的能適用於 FFPE 組織的高通量單細胞 DNA 測序方法、還有其他一些尚未發表的單細胞測序方法。
其表示：「開發設計新的單細胞測序方法，就如木匠做一套新的家具，都需要精心的設計和計算，然後通過不停地嘗試去驗證。雖然摸索的過程比較辛苦，但也不乏跌宕起伏，而每一點進展也都讓人激動不已。新的方法往往給研究的問題帶來新的視角，那種第一次看到別人從來沒有看到過的東西的感覺特別美妙。」
參考資料：
1.Wang, K., Kumar, T., Wang, J., Minussi, D. C., Sei, E., Li, J., ... & Navin, N. E. (2023). Archival single-cell genomics reveals persistent subclones during DCIS progression. Cell, 186(18), 3968-3982.