MET擴增是第二代和第三代間變性淋巴瘤激酶（ALK）抑制劑耐藥的常見機制。在MET擴增/ALK重排（ALK+）肺癌患者中，靶向ALK和MET的聯合治療的緩解持續時間存在差異，提示腫瘤間異質性。然而，關於ALK+ NSCLC亞群的分子組成知之甚少。本研究查詢了組織和血漿資料庫，納入了50多個同時存在ALK重排和MET擴增的樣本。利用螢光原位雜交（FISH）和二代測序（NGS）量化MET拷貝數的範圍，並描述共突變情況。FISH顯示，75%的MET擴增ALK+ NSCLC組織樣本存在高水平擴增（MET拷貝數與7號染色體著絲粒數的比值[MET/CEP7] ≥ 5）。觀察到MET拷貝數的腫瘤內異質性，即使在整體低水平MET擴增的腫瘤中也發現了高水平擴增細胞。對48個MET擴增ALK+ NSCLC血漿樣本的分析發現，在血漿中很少（17%）檢測到高水平擴增。在組織和血漿MET擴增樣本中，EML4-ALK變異體1最常見（51%）。ALK激酶結構域突變僅存在於少數MET擴增ALK+ NSCLC。MET擴增的ALK+ NSCLC血漿樣本中TP53突變（81 % vs 45 %，p = 0.002）、EGFR擴增（17 % vs 4 %，p<0.001）和MYC擴增（21 % vs 3 %，p <0.001）頻率高於MET未擴增的ALK+ NSCLC樣本。本研究表明，MET擴增ALK+ NSCLC通常表現為組織高水平和異質性MET擴增，很少合併ALK突變，經常合併與侵襲性腫瘤生物學相關的變異。
研究背景
MET信號通路的激活主要由MET擴增導致，發生於15-20%的間變性淋巴瘤激酶（ALK）重排（ALK+）非小細胞肺癌（NSCLC），這些腫瘤對下一代ALK酪氨酸激酶抑制劑（TKI）具有耐藥性。回顧性病例系列研究表明，一部分由MET驅動的ALK TKI耐藥患者獲益於靶向ALK和MET的聯合治療。ALK + MET聯合治療的緩解持續時間存在差異，一些患者經歷短暫的緩解，而另一些患者則對治療原發耐藥。儘管缺乏評估雙重ALK + MET阻斷治療的前瞻性試驗，幾項臨床試驗探索了MET抑制劑用於EGFR突變NSCLC，該分子亞群的MET擴增頻率相似。在這些試驗中，將MET TKI加入奧希替尼，30-50%的MET擴增EGFR突變NSCLC部分緩解，MET高水平擴增的腫瘤療效最大。MET擴增水平與MET靶向治療敏感性的這種相關性，與既往ALK/ROS/MET TKI克唑替尼用於MET擴增不伴其他致癌驅動基因共突變腫瘤的研究一致。回顧性分析表明，與這些增加對EGFR和MET聯合治療敏感性的因素相反，MET擴增和其他基因耐藥突變共存可能會損害主要側重於抑制MET旁路信號通路的療法的療效。因此，基於MET的聯合治療成功與否可能同時受到MET拷貝數和整體分子組成的影響。
為了更好地了解MET拷貝數範圍和共突變情況，我們分析了50多例獲得性MET擴增的ALK+ NSCLC患者的組織和血漿樣本，評估MET拷貝數的腫瘤內異質性，識別可能影響靶向療法敏感性的共突變。
研究結果
研究人群
組織隊列來自在麻薩諸塞州總醫院（MGH）接受治療的ALK + NSCLC患者，這些患者重複組織活檢樣本螢光原位雜交（FISH）檢測到MET擴增。MET擴增定義為MET/CEP7≥2.2。當MET/CEP7≥5時，認為存在高水平MET擴增。對於每個組織活檢樣本，分析平均MET/CEP7比值（即50個腫瘤細胞核的MET/CEP7比值）和單個細胞MET/CEP7比值，後者用於評估MET擴增的細胞間異質性。此外，組織樣本還進行了NGS檢測，識別相關共突變。查閱MGH患者病歷，獲取人口統計學和治療史信息。血漿隊列來自Guardant360臨床資料庫中，2014年3月至2022年4月期間，Guardant360血漿樣本檢測顯示存在ALK重排的NSCLC患者。血漿樣本局部MET擴增定義為MET絕對拷貝數≥2.1。
組織隊列
組織隊列包括15例ALK TKI獲得性耐藥患者進展病灶的17個活檢樣本（表1，圖1）。大多數患者沒有吸煙史（n = 11，73%），所有患者在病程中都接受了第二代ALK TKI治療。9例（60%）患者在繼發MET擴增之前未接受過克唑替尼治療。7例（46%）患者洛拉替尼治療期間復發，此時初始活檢顯示MET擴增時。大多數（n = 13，87%）患者為腺癌。
表1. 組織活檢樣本分子檢測結果
圖1. 研究人群
血漿隊列
對兩個血漿隊列進行分析（圖1）。隊列1包括48例MET擴增ALK + NSCLC患者的62個樣本，通過查詢Guardant360臨床資料庫識別。由於Guardant360資料庫去除身份信息，無法獲得有關臨床病理特徵和治療史的信息。隊列2也是常規Guardant360測序產生的去除身份信息的數據集，包括MET未擴增ALK + NSCLC患者的1500多個樣本。
MET擴增ALK+肺癌MET拷貝數範圍
組織活檢樣本MET拷貝數
首先分析了15例MET擴增ALK + NSCLC患者的16個組織活檢樣本，評估MET拷貝數範圍（表1）。從整體隊列17個樣本中排除了1個樣本，因為該樣本是MET靶向治療進展後獲得的縱向活檢樣本。其餘的樣本獲取時患者均未接受過專門針對MET擴增的方案。初始分析集中在總體MET/CEP7比值（即50個腫瘤細胞平均比值）。共分析了16個樣本，包括1例洛拉替尼治療進展時同時獲取胸腔積液和腋窩淋巴結樣本患者的2個樣本。在12/16（75%）個樣本中發現了高水平MET擴增（定義為總體MET/CEP7比值≥5），其餘4個樣本的MET/CEP7比值在2.2和4.9之間。在高水平MET擴增的12個樣本中，6個（50%）的平均MET/CEP7比值為≥25。
接下來，計算了17個組織活檢樣本單個腫瘤細胞的MET/CEP7比值（圖2-3）。為了評估MET拷貝數在不同治療背景下的腫瘤內異質性，將初始數據集擴展到包括患者接受MET靶向治療後收集的2個活檢樣本。除了添加這2個樣本外，先前分析中的1例患者被排除在單個腫瘤細胞分析之外，因為該患者的活檢是在外面做的，無法獲取樣本用於進一步分析。該隊列17個樣本中，8個MET/CEP7比值≥25，5個MET/CEP7比值在5-24之間，4個MET/CEP7比值在2.2-4.9之間。
圖2. 單個腫瘤細胞MET/CEP7比值
圖3. MET基因拷貝數腫瘤內異質性
在MET/CEP7比值≥25的8個樣本中，單個細胞間的比值是統一的，每個細胞的MET/CEP7比值都≥25。相比之下，大多數（n = 4/5，75%）總體MET/CEP7比值在5和24之間的樣本單個細胞MET/CEP7比值不同。例如，1個肝活檢樣本（圖2，圖3中的#7）的總體MET/CEP7比值為7.3，單個細胞的範圍為2.5至≥25。1例患者（圖2中的#12）同時存在局部擴增和多倍體。具體來說，所有單個腫瘤細胞中MET拷貝數≥25，各細胞CEP7探針拷貝數在1-4之間，總體MET/CEP7比值為14。最後，所有4個總體低水平MET擴增（MET/CEP7比值<5）的樣本都同時包含MET未擴增細胞和高水平擴增細胞（圖2-3）。總的來說，該結果支持ALK+ NSCLC患者組織活檢樣本MET拷貝數的腫瘤內異質性，提示即使在整體低水平MET擴增腫瘤中，一部分細胞也具有高水平擴增。
血漿樣本MET拷貝數
在之前的一項研究中，我們證實Guardant360檢測ALK+ NSCLC患者血漿樣本MET擴增具有高靈敏度。該研究包括4例具有配對組織和血漿樣本的MET擴增ALK + NSCLC患者，血漿的MET拷貝數低於相應組織。為了評估更大血漿隊列中MET拷貝數的範圍， 我們查詢了Guardant360資料庫，識別了48例血漿樣本同時攜帶ALK重排和局部MET擴增的患者（血漿隊列#1，圖1）。這些患者血漿樣本MET拷貝數範圍在2.1-16.4之間（圖4A）。28/48例（58%）患者的MET拷貝數在2.1-3之間。只有8例（17%）患者MET拷貝數≥5個。雖然我們沒有該血漿隊列的匹配組織，但結果表明，MET拷貝數的總體範圍，特別是MET擴增水平較高的樣本的分布，在血漿中可能比在組織中窄。
圖4. MET擴增ALK陽性肺癌血漿MET拷貝數和共突變情況
MET擴增ALK+ NSCLC分子圖譜
在EGFR突變NSCLC中，研究發現了MET擴增與其他耐藥機制的重疊。為了評估這一發現是否擴展到MET擴增ALK + NSCLC，我們回顧了血漿和組織樣本的分子圖譜。
ALK激酶結構域突變
由於ALK激酶結構域突變是ALK TKI耐藥的最普遍驅動因素，首先回顧了血漿和組織數據集，確定MET擴增和ALK激酶結構域突變共存情況。所有組織活檢樣本均不含ALK激酶結構域突變。9個（19%）血漿樣本同時具有MET擴增和ALK激酶結構域突變（圖4A）。由於MET擴增ALK+血漿資料庫去除身份信息，治療史不完整，無法確定這些ALK突變是否可能導致對上一種ALK TKI耐藥。在3個（33%）ALK突變與MET擴增共存的樣本中，血漿檢測到的ALK突變為L1196M守門人突變，該突變與對下一代ALK TKI的耐藥性無關。
其他基因共突變
接下來，分析血漿樣本分子譜，確定最常見的共突變基因（圖4B）。MET擴增ALK+ NSCLC血漿樣本中突變頻率≥10%的基因包括TP53（81%）和ATM（10%），擴增頻率≥10%的基因包括MYC（21%）和EGFR（17%，圖4B）。除了上述這些較常見的共突變外，潛在相關的耐藥共突變包括KRAS G12D（n = 1）和NRAS G12D（n = 1）。評估了這些共突變在1500多個MET未擴增ALK + NSCLC血漿樣本擴展數據集中的頻率。MYC擴增（21% vs 3%，p < 0.001）、EGFR擴增（17% vs 4%，p < 0.001）和TP53突變（81% vs 45%，p < 0.001）在MET擴增的ALK+樣本中頻率更高，提示這些變異可能在MET擴增的ALK+ NSCLC中富集。
EML4-ALK融合變異體
ALK激酶結構域突變是ALK靶向治療耐藥機制之一，不同的EML4-ALK融合變異體可能與ALK激酶結構域突變發生傾向不同有關。為了評估MET擴增是否好發於攜帶某種特定EML4-ALK變異體的腫瘤，確定了我們血漿和組織MET擴增ALK + NSCLC數據集的EML4-ALK融合變異體。11個組織活檢樣本檢測到EML4-ALK融合（表1），包括變異體1（n = 6）、變異體3（n = 2）、變異體5（n = 2）和變異體8（n = 1）。MET擴增血漿隊列中，36例患者融合伴侶和EML4-ALK變異體信息可及，其中34例檢測到EML4-ALK融合。其餘樣本的融合伴侶為KLC1和KIF5B。在血漿樣本中觀察到以下EML4-ALK變異體：變異體1（n = 17），變異體2（n = 2），變異體3（n = 11）和其他（n = 4）。總體而言，在51%（n = 23/45）的可評估的組織和血漿MET擴增樣本中檢測到EML4-ALK變異體1。
討 論
儘管研究表明，MET擴增導致ALK TKI耐藥，但關於該耐藥機制的大型臨床研究較少。為此，本研究納入了50多例MET擴增ALK + NSCLC患者樣本。本研究結果表明，MET擴增的ALK+ NSCLC通常表現為組織高水平MET擴增，且MET擴增經常與傳統上與侵襲性腫瘤生物學相關的分子變異（TP53突變和MYC擴增）共存。
在多種情況下（作為新發致癌驅動突變和獲得性耐藥事件），MET擴增賦予MET治療靶向敏感性，特別是當MET高度擴增時。由於耐藥機制通常是亞克隆事件，因此可以想像，對ALK + MET聯合治療的反應深度和持續時間可能取決於疾病部位的MET拷貝數和MET拷貝數的分布。為了評估MET擴增ALK + NSCLC的分子異質性，我們進行了從單個腫瘤細胞到整體血漿的分析。通過該分析，我們觀察道單個腫瘤活檢樣本腫瘤細胞間的MET拷貝數異質性，特別是在MET擴增水平較低的腫瘤中。然而，在我們的分析中，組織樣本MET圖譜主要由高水平MET擴增定義。在切除的EGFR突變NSCLC中也描述了MET擴增的空間異質性，特別是在FISH低水平或臨界MET擴增腫瘤中。考慮到MET靶向治療在MET擴增水平較高的EGFR突變NSCLC中療效較好，高水平MET擴增的統一性可能是獲益的預測指標，而腫瘤中同時存在非MET擴增細胞和低水平或臨界MET擴增細胞可能對該療法產生不利影響。在ALK + NSCLC中缺乏類似的前瞻性研究，或許可以評估臨界或低水平MET擴增的ALK + NSCLC患者的早期反應，來確定基於MET的聯合治療的療效。
關於MET擴增ALK + NSCLC的整體分子圖譜，大多數血漿樣本MET拷貝數≤5。血漿拷貝數受組織拷貝數和整體ctDNA脫落的影響，預計不會等同於組織拷貝數。組織與血漿中高水平MET擴增發生率的存在差異的原因之一可能是空間異質性導致MET拷貝數稀釋。因此，在分析血漿拷貝數及其對估計組織拷貝數的潛在效用時，考慮異質性和腫瘤脫落非常重要。
此外，本研究還關注可能影響疾病生物學和對MET選擇性療法敏感性的高頻共突變。在我們的血漿和組織樣本中，很少觀察到可操作ALK突變和其他可靶向基因共突變。血漿分析顯示，在MET擴增ALK+樣本中，>80%存在TP53共突變，TP53共突變及MYC和EGFR共擴增頻率超過在MET未擴增ALK+ NSCLC中觀察到的頻率。值得注意的是，對Guardant360資料庫的查詢也顯示，與非MET擴增的EGFR突變NSCLC相比，MET擴增的EGFR突變NSCLC中MYC擴增富集（11% vs 2.6%）。在ALK+ NSCLC和EGFR突變NSCLC中，MYC擴增和TP53突變都與侵襲性腫瘤生物學有關，這可能解釋了接受EGFR和ALK靶向治療的患者中，MET擴增與早期復發的有趣關聯。此外，VISION研究顯示，在一組血漿高水平MET擴增、沒有其他致癌驅動因素的患者中，血漿MYC共擴增與特泊替尼的無進展生存期較短有關。因此，這些共突變可能會抵消高水平MET擴增的有利發現，對MET靶向治療的反應持久性產生不利影響。
本研究有幾個局限性。首先，儘管這是目前為止關於MET擴增ALK+ NSCLC的最大研究，但所研究基因型的整體罕見性以及我們分析對去除身份信息基因組數據集的依賴性阻礙了深入的臨床分析。其次，我們的血漿隊列缺乏配對的組織樣本，因此無法評估MET拷貝數的組織-血漿一致性。第三，我們關於組織樣本中MET拷貝數腫瘤內異質性的結論是基於對有限數量的樣本的回顧。由於這些組織樣本是通過對來自未經選擇的ALK+ NSCLC患者的>100個組織樣本的MET拷貝數的系統分析識別的，無意中過度代表侵襲性腫瘤的可能性較低。儘管如此，在更大的隊列中進行獨立驗證對於確認我們的觀察結果至關重要。第四，我們的分析不包括治療史，因此不能得出關於基因變異對治療結果影響的明確結論。最後，本研究關注MET擴增，而ALK+ NSCLC中已經描述了MET激活的其他非基因機制。鑒於基於抗體的MET靶向療法的出現以及EGFR突變NSCLC中這些療法的療效與MET表達之間的明確關係，ALK+ NSCLC中MET旁路依賴性指標應在未來的研究中得到全面探索。
總之，本研究表明，MET擴增ALK + NSCLC通常存在高水平MET擴增，且通常與導致侵襲性生物學、預示不良治療結果的突變共存，這可能從分子層面解釋了為什麼已發表病例系列研究中ALK + MET聯合治療的療效中等。
參考文獻：
Dagogo-Jack I, Kiedrowski LA, Lennerz JK. Molecular heterogeneity and co-altered genes in MET-amplified ALK-positive lung cancer: Implications for MET targeted therapy. Lung Cancer. 2023 Sep 23;186:107383. doi: 10.1016/j.lungcan.2023.107383. Epub ahead of print. PMID: 37813016.