9 月 20 日，全球第二例豬-人心臟移植手術在美國馬里蘭大學成功實施。2022 年 3 月，世界上第一位進行基因編輯豬心臟移植的患者大衛·貝內特（David Bennett），在術後存活達 60 天。
其使用的異種移植器官方案，是通過基因編輯技術將豬的基因改造接近於人類，從而減輕排斥反應。這一重大進展是在中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院研究員賴良學21 年前取得的突破基礎上，進一步對豬進行 10 個基因改造後獲得的。
圖丨賴良學（來源：賴良學）
當時，克隆羊技術剛剛開始起步。2002 年，在美國密蘇里大學動物中心從事博士後研究的賴良學，成為基因編輯修飾克隆豬「第一人」，並通過基因敲除技術結合克隆技術，成功構建了半乳糖苷轉移酶基因敲除克隆豬模型，一舉解決了豬器官移植入人體的超急性排斥反應問題[1]，轟動整個學術圈。這項發表在 Science 的研究被美國國家研究資源中心認為是異種器官移植領域的重大突破，稱該研究為「里程碑式進展」。
21 年後，賴良學與合作者們在基於大動物解決供體器官短缺問題的道路上，樹立了又一重要的「里程碑」——首次成功在腎臟缺陷豬模型體內培育出人源中期腎臟[2]。 經統計，中腎內的人源細胞占比高達 70%。
「最激動人心的時刻，是當我們把嵌合胎兒拿出來，通過螢光顯微鏡觀察到大片紅色螢光出現在其腰部位置。這意味著，經歷了五年的反覆探索實驗，離成功八九不離十了。」賴良學感嘆道。
通過一系列後續實驗排除了假螢光等因素，研究團隊確認了來自豬腎臟位置的螢光正是人源細胞所發出。這些人源多能幹細胞在腎臟缺陷胚胎中發育了 28 天后，成功嵌入到了豬的中腎內，進而形成中腎小管，使原本表現出缺陷的腎臟具有完整的結構。
圖丨Cell Stem Cell 當期封面（來源：Cell Stem Cell）
近日，該項研究成果以封面論文形式發表於 Cell Stem Cell。封面上，是一隻攜百寶飛來的小豬。賴良學研究員表示，豬能飛是一件很神奇的事情，也是一件看似「不可能」的事情，這也預示著我們的這項研究「將不可能變為可能」。
有趣的是，這只會飛的小豬手中捧著一個葫蘆，葫蘆中裝的「靈丹妙藥」正是用於構建人源中腎的誘導性多能幹細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。該團隊獲得的新型人源 iPSCs 是該研究成功的關鍵因素之一，在基因修飾技術改造和新型培養體系的加持下，這些細胞的分化潛能和生存能力大大增強，並最終成功使豬身上「長出」含有大量人源細胞的功能性實質器官。
「我們希望在豬體內再造的腎臟可用於造福人類。」賴良學研究員指出，該技術不僅能夠用於人體器官的發育以及發育性疾病的研究，其「終極目標」是獲得可用於人體器官移植的功能性器官。
讓幹細胞同時具備高分化能力和強生存能力
「在經歷了不斷的探索和失敗，我們取得了成功。這看似偶然的背後，和團隊過去在基因編輯、基因改造、胚胎操作、幹細胞等領域每一步堅實基礎和技術的累積都密不可分。」賴良學感嘆道。
為獲得異種嵌合能力更強的細胞，研究團隊解決了兩個關鍵問題。在前期工作中，米格爾·A·埃斯特萬（Miguel A. Esteban）研究員課題組發現向幹細胞培養基中加入四個小分子化合物以及白血病抑制因子，能夠獲得分化能力與人類早期胚胎細胞相似的幹細胞。
幹細胞與早期胚胎細胞的相似程度對其能否最終形成各種組織器官至關重要，而這一培養體系為幹細胞賦能，使其具有了更高的分化潛能，為其在豬胎兒體內能夠順利形成目標器官提供了重要保障。
為了使人源細胞在異種體內更好地存活，潘光錦研究員課題組對種間差異障礙的機制進行探究。他們發現在人源幹細胞中過表達 MYCN 和 BCL2 這兩個基因，能夠有效避免由於物種間差異導致的人源細胞在異種動物體內大量凋亡。課題組前期的研究成果也證明，過表達 MYCN 和 BCL2 的人源細胞可在血管缺陷小鼠體內生成人的血液幹細胞。這樣，在高分化能力和強生存能力的「強強聯合」下，研究人員獲得了異種嵌合能力強的細胞（4CL/N/B 細胞）。
（來源：Cell Stem Cell）
另一方面，該團隊利用基因編輯技術，創製出了新型腎臟缺陷豬模型。具體來說，研究人員通過新型基因編輯工具，結合體細胞核移植技術及胚胎顯微注射，克隆得到了腎臟發育關鍵基因 SIX1 和 SALL1 敲除的腎臟缺陷豬模型。
與此同時，研究人員利用新型基因編輯工具，將體細胞核移植技術和胚胎顯微注射結合後，通過克隆得到了腎臟發育關鍵基因 SIX1 和 SALL1 敲除的腎臟缺陷豬模型。該多基因修飾的腎臟缺陷豬模型表現出嚴重的中腎發育缺陷，後腎完全缺失，為人源細胞提供充足的發育空間。
圖丨胚胎內的人源化腎細胞（紅色螢光）與野生型豬胚胎對比（來源：Cell Stem Cell）
此外，胚胎補償技術體系的各個環節都會影響嵌合胚胎的發育，這也是實現人源器官異種體內再造所要解決的關鍵難題之一。在這方面，合作團隊進行了多次嘗試、走過了很多「彎路」，最終確定了構建嵌合胚胎的理想技術方案：向發育至桑葚胚以及早期囊胚階段的重構豬胚胎，進行 3-5 個人類幹細胞的注射。
同時，鑒於人細胞及豬胚胎在體外培養時需要不同的培養條件，研究人員還探索了適用於體外培養嵌合胚胎的培養條件。最終，確定了適用於培養嵌合胚胎的在體外培養體系。
結合上述構建的高分化潛能、強增殖及抗凋亡能力的多能幹細胞，優化的胚胎補償技術體系，以及多基因修飾腎臟缺陷豬模型。研究團隊最終成功在豬體內再生了人源中腎。
圖丨相關論文（來源：Cell Stem Cell）
最終，相關論文題目為《利用人多能幹細胞基於胚胎補償技術在豬再生人源中期腎臟》（Generation of a humanized mesonephros in pigs from induced pluripotent stem cells via embryo complementation），並作為當期論文封面發表在 Cell 子刊 Cell Stem Cell[2]。
該論文第一作者為中科院廣州生物醫學與健康研究院博士後王教偉，共同通訊作者為賴良學研究員、戴禎研究員、米格爾·A·埃斯特萬（Miguel A. Esteban）研究員、潘光錦研究員。
為獲得供體器官提供新方案
在中國，因器官衰竭需要做器官移植手術的人數每年大概有 30 萬，僅靠人體器官捐獻遠不能填補這一缺口。為此，科學家們也一直在探索更多可獲取供體器官的新方法。找到適合的器官供體，意味著可以延長患者的生命並改善其生活質量。
通過生物工程技術在動物體內再造可用於移植的人源器官，是解決供體器官短缺的理想方案之一，該方案也被稱之為「異種嵌合技術」。早在十幾年前，這一策略的理論可行性已經在基於嚙齒類動物的研究中得到驗證。
由於小鼠和大鼠的妊娠期相近，胚胎髮育時間也基本一致。因此在早期，科研人員首先基於二者進行了異種器官體內再造的相關研究。多項研究成果證明應用異種嵌合的策略，可在大鼠或小鼠體內實現胰臟、肝臟等多種器官的種間再造。
2019 年 11 月，中國科學院動物研究所周琪院士團隊把猴子的胚胎幹細胞注入豬胚胎中，並最終培育出 2 只體內含有猴子細胞的「嵌合體」豬，世界上首例「豬猴嵌合體」由此產生。該研究證明靈長類動物的細胞能夠在豬的體內形成嵌合，但在嵌合體中，猴細胞的嵌合比率十分有限。這其中的重要原因之一，或許是研究中應用的載體豬沒有提供器官生態位空缺。
2021 年 4 月，昆明理工大學靈長類轉化醫學研究院季維智院士與合作者在Cell上報道成功構建了首個「人猴嵌合胚胎」[3]。研究人員把人類幹細胞注射至靈長類動物食蟹猴胚胎，二十天的體外培養後，人類細胞所占在嵌合胚胎中的占比達 4%。該項研究為研究人類胚胎的早期發育提供了重要參考。
人和猴都屬於靈長類動物，起源關係更近，且猴子妊娠期為 5 個半月，和人類差異更小。但也正是由於這些原因，若將人猴嵌合胚胎植入代孕母猴並最終產出嵌合胎兒，可能會導致更為嚴重的倫理問題。
因而目前國際上仍不允許對人猴嵌合胚胎進行子宮移植。另外，構建基因修飾器官缺陷猴模型的技術體系尚不完全成熟、效率仍然較低。因此，目前尚無法基於人猴嵌合體獲得可用於移植的人類器官。
圖丨克隆豬（來源：賴良學）
那麼，通過豬再造人類器官有哪些優勢和差異呢？從豬的器官的結構、大小和基因來看，其與人相似，但二者在某些生理特徵存在一定的差異，比如人的體溫是 37℃，而豬的體溫為 38.5℃，再如人豬胎兒還存在發育不同步的問題，從妊娠時間上來看，人和豬的胚胎髮育時間上存在很大的差異，人的妊娠期為 10 個月，而豬的妊娠期在 114 天左右。
不可忽視的是，人們對異種移植會有一個隱性的擔憂——將人源細胞嵌入在豬體內，豬會不會變成人類呢？
賴良學表示：「這在技術上實際上是做不到的，我們只是針對某個器官在豬體內進行培養。其中涉及的倫理要求是，不能在豬體內出現人類的神經細胞，以及人類的生殖細胞（精子和卵子）。」
在這次研究中，研究人員只在胎齡 28 天胎兒的脊髓內檢測到了少量的人源神經細胞，但並未檢測到人類生殖細胞的形成。未來，也將通過將人源細胞的神經及生殖發育關鍵基因敲除的方式，最大限度防止相關爭議的產生。
從基因敲除克隆豬「第一人」，到首次在豬體內培育人源中腎
2007 年回國後，賴良學受聘為吉林大學畜牧獸醫學院教授及中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院研究員。研究方向主要包括基因修飾大動物模型構建及應用、新型基因修飾技術及克隆技術的開發及優化、人類及動物多能幹細胞的分離培養等。
2018 年，他與暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院李曉江教授團隊合作，在Cell 報道首次成功建立了亨廷頓舞蹈症轉基因豬模型[4]。此外，他還構建出多種具有重要應用價值的功能性蛋白人源化豬模型，這些豬模型將可用於生產如胰島素、凝血因子、血靜脈蛋白等重要的醫用蛋白製劑，具有廣闊的市場前景。
在本項已發表的研究中，賴良學及合作團隊在豬體內培養出人源腎臟。而基於這項工作，他們已經開始著手實現在豬體內再造如心臟、胰臟、肝臟、肺臟等其他重要器官。對於培養難度最大的心臟，賴良學說：「胰臟即便是發育不健全只有 70-80%，也可以存活。但心臟必須做得非常完善，才能保證維持生命。」
從理論上來說，隨著幹細胞技術的進步和個性化醫療的發展，未來可能實現這樣的情景：患者想獲得某種器官用來移植，可從皮膚中取出一塊讓其成為幹細胞，然後在豬身體中長出相關器官。賴良學指出，這個器官取自患者自己，又用於同一個人，因此會大幅度降低排異反應，這種路徑也會更具優越性。
他認為，未來需要最先攻克的問題是如何延長含有人源器官的嵌合胎兒在豬體內的發育時間。基於已解決的幹細胞分化能力的問題，因此未來其可能提高的幅度不會太大。但同時他也指出，種間差異方面還要努力克服更多的障礙。例如，基因表達的差異（影響生成能力）等。
另一方面，如何解決人類和豬發育同步化的問題需要進一步解決。「我相信隨著國家在該領域投入經費的增多，以及更多合作者的共同參與，這方面會取得更大的突破。」賴良學最後說道。
參考資料：
1.Lai, L.,……,Randall S Prather. Production of α -1,3-Galactosyltransferase Knockout Pigs by Nuclear Transfer Cloning. Science 295(5557):1089-1092 ( 2002).
2.Wang,J.,……,Lai, L. Generation of a humanized mesonephros in pigs from induced pluripotent stem cells via embryo complementation. Cell Stem Cell 30,9,1235-1245 (2023). https://doi.org/10.1016/j.stem.2023.08.003
3.Tan,T.,et al. Chimeric contribution of human extended pluripotent stem cells to monkey embryos ex vivo. Cell 184, 8, 2020-2032 (2021). https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.020
4. Yan, S., ……, Lai, L., Li, X. A huntingtin knockin pig model recapitulates features of selective neurodegeneration in huntington's disease. Cell. 2018, 173(4): 989-1002.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9671127/
http://www.gibh.cas.cn/sourcedb_gibh_cas/yw/zjrcyw/200907/t20090711_2065032.html