近年來，非小細胞肺癌的治療發生了革命性的變化。EGFR酪氨酸激酶抑制劑的出現推動了新的治療方案的產生。液體活檢已成為一種有用工具，在聯合低劑量CT掃描的早期診斷以及監測治療應答和預測患者疾病發展方面顯示出潛在效用。本文應用液體活檢技術對38例攜帶EGFR突變的非小細胞肺癌患者在腫瘤進展的不同階段的循環腫瘤DNA（ctDNA）進行研究。研究結果顯示，液體活檢單變量分析，EGFR突變陽性患者的平均總生存期顯著低於野生型患者（29±4個月vs.104±19個月；P= 0.004），多變量分析也得出同樣結論（P= 0.008）。由此可見，液體活檢可能是提高生存率的關鍵。
背 景
肺癌是全球癌症死亡的主要原因，占新發癌症的11.4%，占癌症死亡總數的18%。肺癌主要分為兩種類型：小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC）。約85%的肺癌為NSCLC，包括不同組織學亞型，如腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌。高達80-90%的NSCLC患者在診斷時表現出與原發腫瘤相關的呼吸系統症狀；也可能出現與轉移灶相關症狀，尤其是中樞神經系統受累導致的神經症狀和骨痛。吸煙是NSCLC最主要的危險因素之一。但觀察到NSCLC非吸煙女性患者的增加，其潛在原因尚不清楚（例如，可能與激素暴露、既往為治療其他惡性腫瘤（如乳腺癌）而進行的放療、家庭環境因素等有關）。
肺癌的治療取決於病理類型、臨床分期、分子特徵和對患者臨床症狀的評估。手術是最有效的治療方法，但僅限於I、II或IIIA期NSCLC患者（僅占總病例的35%）。由於大多數NSCLC患者在診斷時已處於晚期，因此細胞毒性藥物的全身性治療常被用作標準治療，並顯示出一定的生存獲益。
隨著對NSCLC中促進腫瘤發生髮展的潛在分子機制更多了解，許多針對特定基因變異的靶向工具得以開發。表皮生長因子受體（EGFR）基因激活突變的發現，以及EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）的研發，對晚期NSCLC患者的個體化治療產生了重要影響，改善了患者的生存期。除了這些針對EGFR突變的TKIs外，近年來，通過針對ALK、ROS1、RET、BRAF和KRAS等基因變異藥物的研發，以及基於PD-1/PD-L1表達的免疫治療，使肺癌的治療發生了革命性突破。因此，NSCLC將個體化治療帶到了全球的前沿，最新發布的指南建議晚期非鱗狀NSCLC和部分鱗狀細胞癌（SCCs）患者應進行基因檢測。
儘管目前在腫瘤早篩、早期復發監測、靶向治療耐藥監測等方面取得了進展，但挑戰仍然存在。組織樣本是指通過手術或活檢等方式採集的腫瘤組織。應考慮對於難以取得組織或取得腫瘤組織不夠進行基因檢測的患者。
液體活檢（LB）是一種微創方法，基於分析生物液體（主要是血液）中的循環腫瘤細胞（CTCs）、血漿中的游離DNA（cfDNA）、循環miRNA、外泌體和腫瘤誘導血小板（TEP）。該方法已成為識別癌症患者分子變異的有力工具。液體活檢具有無創性、可動態監測、克服腫瘤異質性等優點。主要的制約是ctDNA含量極低。目前，有各種可用的方法和平台，然而，關於何時是否進行液體活檢尚未達成明確共識。
西班牙薩拉曼卡大學醫院根據腫瘤內科服務指南對患者進行LB檢測EGFR突變狀態。本研究的目的是分析該院對EGFR突變型NSCLC患者的臨床管理，並評估了LB技術對患者腫瘤演變和OS的影響。
研究結果
38例患者中，男性17例（45%），女性21例（55%），中位年齡為68歲（43-85歲）。大多數（25；66%）為非吸煙者（表1）。功能狀態在兩個級別進行評估。38例患者表現出良好的一般狀態，根據ECOG評分標準，24例為0分（66%），其餘14例為1分（34%）。值得注意的是，18%的患者（7例）完全無症狀，其診斷具有偶然性。22例（58%）患者出現與原發腫瘤相關的症狀，主要表現為咳嗽、咳痰、咯血、呼吸困難或胸痛；9例（24%）患者出現與轉移部位相關的症狀，突出表現為神經系統和脊柱不同水平的疼痛。近四分之三的患者為Ⅳ期疾病（28例，74%）；5例患者為Ⅲ期局部晚期疾病（13%），少數患者為早期疾病（3例Ⅰ期患者，8%；2例Ⅱ期患者，5%）。大多數患者未接受手術治療（33例；87%），因此，其組織學診斷是通過小活檢（經支氣管活檢、空芯針穿刺活檢（CNB）、細針穿刺活檢（FNA）或基於胸腔積液分析的細胞學檢查）獲得。
表1 液體活檢檢出EGFR突變型NSCLC患者（n= 38）的臨床和生物學特徵。
在接收的38例樣本中，95%被診斷為腺癌，2例（5%）被診斷為未分化NSCLC（表2）。一方面，所有患者的p40均為完全陰性。另一方面，91%（35例）患者的TTF1呈陽性，對3例TTF1陰性患者中的2例（9%）進行了PAS和PAS澱粉酶檢測，結果均為陽性。
表2 對38例EGFR突變的NSCLC患者進行組織病理學分析。
在組織樣本中，del（19）和L858R突變是最常見的EGFR突變類型（n=32；84%），其次是Ins（20）（n=3；8%）和del（19）+ L861Q（n=1；3%），del（19）+ T790M（n=1；3%）、G719X + S578I（n=1；3%）復合突變（表S1）。在38例患者中，32例（84%）一線治療使用第一代EGFR TKIs，其中20例接受厄洛替尼，10例接受吉非替尼。2例患者因Ins（20）突變耐藥而接受化療。此外，4例（10%）患者在術後復發並接受了化療。
表S1 液體活檢技術檢測EGFR基因突變狀態與ALK、ROS1和BRAF基因變異的相關性。
該隊列中所有患者進行了至少1次液體活檢，以研究EGFR突變類型（表S2），中位隨訪時間為24個月（4-154個月）。所有LBs均按照醫院腫瘤內科要求進行。如圖1所示，在71%的患者（n=27）中，LB檢測到至少1種EGFR突變類型，其中del（19）和L858R是最常見的突變類型（10例；26%），其次是del（19）+T790M復合突變（4例；10%）。在疾病監測期間，13例患者出現T790M耐藥突變，故改用奧希替尼。只有1例患者在診斷時就發現了這種突變（與del（19）相關）。在這13例患者中，T790M突變的中位發病時間為34個月（7-78個月）。
圖1 38例EGFR突變的NSCLC患者血漿樣本LB檢測到的EGFR基因突變的類型和突變丰度。
表S2 隨訪EGFR突變的NSCLC患者(n=38)血漿標本中EGFR基因突變類型。
與預期一樣，TTF1在大多數病例中呈陽性（n=36；95%），然而，在半數的研究病例中檢測到腫瘤細胞中的表達，其與LB陽性無關（表2）。
最後，患者的平均OS為48±10個月。在患者監測期間，38例患者中有31例死亡（82%），LBs陽性和陰性患者之間差異具有統計學意義（分別為27例（71%）和11例（29%），p = 0.004）。從預后角度來看，單變量分析中顯示對OS有顯著影響的變量是治療、ECOG和LB（p < 0.05）（表3）。然而，在多變量分析中，只有LB保持顯著性（HR = 4.7；p = 0.008）， LBs陽性組和陰性組患者的平均OS分別為29±4個月vs.104±20個月（p = 0.004）（圖2）。
圖2 疾病隨訪期間，在EGFR突變的NSCLC患者的血漿LB中發現至少1種EGFR基因突變類型，在單變量（p = 0.004）和多變量（p= 0.008）分析中顯示對OS有顯著影響。
表3 EGFR突變的NSCLC患者（n= 38）的臨床、生物學和基因學特徵及其與OS的相關性。
討 論
EGFR突變已成為NSCLC患者，尤其是晚期患者非常重要的治療靶點，其對患者的OS和生活質量都有重大影響。因此，提高對基因變異的認知，以及LBs在檢測和監測該類患者中發揮的作用，對於改進和調整治療方案以符合患者的疾病階段至關重要。肺癌患病率導致了近年來個體化醫療的發展，並通過要求臨床機構整合臨床數據、病理結果和分子譜分析，徹底改變了患者的管理方式。
本文研究結果與既往文獻中研究患者的概況相符。總體而言，本文患者中有60%為女性，67%自稱不吸煙。這證實了NSCLC女性患者增加的趨勢，尤其是非吸煙者。儘管男性的吸煙率隨著時間的推移普遍下降，但仍居高不下。在本研究中，有一半的男性患者（n=8）是吸煙者或曾吸煙者，而這種情況只在23%的女性患者（26例中有6例）中被發現。據估計，53%的肺癌患者在55-74歲之間被診斷出，在本研究中，診斷的中位年齡為68歲。值得注意的是，女性中位確診年齡比男性大約8歲（65±13歲 vs. 72±10歲），這可能是由於女性吸煙率較低，但與吸煙無關的肺癌病因尚未明確（如激素暴露、乳腺癌等其他腫瘤導致的既往放療或環境因素），也未明確其特徵。
儘管手術是早期NSCLC患者的最佳治療方式，但約35-55%的患者在術後5年內復發。導致這種情況的原因尚未完全闡明，但有學者認為與病變中實性成分的比例、組織學亞型、微乳頭生長方式、壞死、空氣播散等有關。本研究38例患者中，5例處於疾病早期（Ⅰ-Ⅱ期），手術後，所有患者在整個病程中均出現局部或遠處復發。然而，高達80%的肺癌患者被診斷為晚期，其主要診斷技術通常是小活檢或FNA。本研究中幾乎90%的患者處於局部晚期（n=6；14%）或轉移性（n=32；74%），這證實了肺癌通常是在治療選擇有限的晚期被診斷出來的。正因為如此，人們正在廣泛研究能夠進行早期診斷的檢測系統，從而增加治癒性治療策略的可能性。在這方面，已經有研究證明了低劑量計算機斷層掃描（LDCT）作為早期疾病篩查，使患者從中獲益。然而，這種方法具有局限性，例如篩查結果容易產生偽陽性（導致誤診，過度治療）或有極低可能性接受癌症篩檢暴露的放射線而患癌症。為了解決這些問題，人們正在探索LB作為LDCT輔助工具的價值，既可以作為篩查方法，也可以通過外周血分子鑑定輔助疾病早期的診斷。事實上，TRACERx研究表明，ctDNA可在影像學檢測到的病變出現前6-12個月被檢出，在特定人群中，ctDNA可作為LDCT的補充，從而減少診斷干預的數量。
既往研究表明，del（19）和L858R突變是NSCLC患者中最常見的EGFR突變類型，其次是ins（20）。與其他使用類似方法論的研究一致，本文研究結果顯示，近半數的NSCLC病例中存在del（19）和L858R。僅在2例患者中觀察到復合突變（G719X + S578I和del（19） + L681Q）。據報道，EGFR復合突變其發生率占所有EGFR突變的5% -15%，本研究在6%的患者中觀察到復合突變，與既往報道一致。在初診時存在T790M突變的情況較為罕見。事實上，有人認為其是EGFR基因的胚系突變，並且與不良預後相關。在本研究中，只有1例患者在診斷時出現了與del（19）+ T790M復合突變，與其他攜帶不同突變類型的患者相比，中位生存期未觀察到顯著差異（19個月vs. 20個月）。
雖然在NSCLC的診斷和隨訪中不推薦常規進行LB檢測，但本研究獲得的結果雖小，卻具有顯著意義。本研究觀察到，隨訪期間LB未檢出EGFR突變的患者，總生存期是LB中檢出至少攜帶1個EGFR突變患者的4倍（平均OS分別為29±4個月vs.104±19個月；P=0.001）。這些數據表明LB對NSCLC患者的預後具有強大的預測價值。在本文研究中，使用定量PCR，然而，目前有更敏感的技術，如微流控技術（數字PCR和BEAMing）或高通量測序（NGS），可進一步提高EGFR基因突變狀態的預測價值。在FASTACT-2試驗中對基於血液的EGFR突變狀態評估的前瞻性分析表明，LB是一種相對敏感且高度特異性的突變檢測方法。在基線時具有基於血液的EGFR突變陽性結果的患者中，血液樣本中EGFR狀態的動態變化與療效結果有關。同樣，LUNGCA-1研究發現，術後患者通過LBs檢測可預測復發。儘管除了尋找耐藥突變（第一代或第二代EGFR-TKI的T790M耐藥突變；第三代EGFR-TKI的C797S耐藥突變）或觀察到患者對治療的反應降低後，對於何時進行LB檢測尚未達成共識，本文研究結果加強了將其納入常規腫瘤檢測的想法。在開始治療前和/或術後進行LB檢查，並在靶向治療第一年每3個月進行一次，因為這時通常會出現耐藥突變。
據報道，奧希替尼在EGFR突變陽性晚期NSCLC的一線治療中顯示出優於標準EGFR-TKIs的療效，具有相似的安全性和較低的嚴重不良事件發生率。本研究在整個隨訪期間，LBs在13例（34%）患者中檢測到T790M耐藥突變。因此，LBs有可能作為有效的治療策略，對患者生活質量和生存產生積極影響。目前已知的奧希替尼耐藥的突變機制，如在本研究7%的病例中存在的T790M缺失或C797S突變，隨著時間的推移，新的NGS技術將提供更多關於耐藥機制的信息。
綜上所述，本文研究結果表明，在EGFR突變的NSCLC患者中，LB技術檢測到的EGFR基因突變是OS的獨立預後因素。液體活檢以相對簡單、快速的方式監測腫瘤基因突變，這一方法與其他診斷工具一起，可能有助於日常臨床實踐，改善預後評估，並指導NSCLC患者治療的臨床決策。未來需要更大樣本的前瞻性研究來驗證LB技術在NSCLC患者診斷和隨訪中的應用價值。
參考文獻：Roldan Ruiz, J.; Fuentes Gago, M.G.; Chinchilla Tabora, L.M.; Gonzalez Morais, I.; Sayagues Manzano, J.M.; Abad Hernández, M.; Cordovilla Pérez, M.R.; Ludeña de la Cruz, M.D.; del Barco Morillo, E.; Rodriguez Gonzalez, M. The Impact of Liquid Biopsies Positive for EGFR Mutations on Overall Survival in Non-Small Cell Lung Cancer Patients. Diagnostics 2023, 13, 2347. https://doi.org/10.3390/diagnostics13142347