第3類BRAF（B-Raf原癌基因，絲氨酸/蘇氨酸激酶）變異包括G466、 D594和A581突變導致激酶死亡或激酶活性受損。RAF（RAF原癌基因，絲氨酸/蘇氨酸激酶）抑制劑在第3類突變驅動腫瘤中抑制ERK（細胞外信號調節激酶）信號不太可能，因為它們優先抑制激活的BRAF V600突變。然而，有跡象表明，第3類突變仍然與RAS/MAPK （RAS原癌基因，GTPase/絲裂原激活蛋白激酶）激活增強有關，這可能是由於其他機制，如生長因子信號通路的激活或同時發生的MAPK通路突變，例如：RAS或NF1（神經性纖維瘤1型）。一例75歲男性肺鱗狀細胞癌（SqCC）患者，腫瘤轉移至腎臟和縱隔淋巴結，隨後接受化療聯合免疫治療（2%的腫瘤細胞表達PD-L1）。由於並發骨髓增生異常綜合徵（MDS），化療受限，帕博利珠單抗單藥治療持續了7個周期。在疾病進展時，患者進行了NGS檢測，在BRAF基因中發現了c.1781A>G（p.Asp594Gly）突變，在NF1基因中發現了c.1381C>T（p.Arg461Ter）突變，在FANCC基因中發現了c.37C>T（p.Gln13Ter）突變。使用BRAF抑制劑（達拉非尼）和MEK抑制劑（曲美替尼）聯合治療，導致原發病灶和肺結節部分緩解，腎臟和骨骼轉移灶穩定。由於MDS相關的骨髓抑制，5個月後停止治療。分子檢測結果對患者的命運具有決定意義。BRAF基因非v600突變的NSCLC患者對於抗BRAF和抗MEK治療很少有反應。該治療取得的效果可能與NF1腫瘤抑制基因的突變有關。NF1功能的喪失導致KRAS的過度激活和包含BRAF和MEK的信號通路的過度激活，而BRAF和MEK是治療的靶點。此外，FANCC基因突變可能與MDS的發生有關。NGS技術對於我們患者的治療資格評審和NSCLC病程的預測至關重要。BRAF致癌基因和NF1腫瘤抑制基因的突變是使用達拉非尼和曲美替尼治療的原因。患者在短期內病情穩定。這證明了這些基因的共存突變會影響疾病進程和治療效果。
背景
BRAF突變的特徵是BRAF基因1781 nt位點的核苷酸由A變為G，這會導致BRAF蛋白鏈中的天冬氨酸被甘氨酸取代（p.Asp594Gly，p.D594G）。在COSMIC（catalog of Somatic Mutations in Cancer）和ClinVar資料庫中，BRAF突變被描述為致病變異或意義未知的變異（VUS）。據報道，BRAF變異在大腸癌、皮膚癌和胃癌中是一種體系突變，在肺腺癌中觀察到高達11%的BRAF突變。在本文的患者樣本中發現的基因變異與最常見的藥物反應型突變p.V600E（p.Val600Glu）相近。BRAF第600號密碼子以外突變在1-3%癌症中被檢測到，包括許多常見的腫瘤類型（肺、結腸、前列腺、婦科惡性腫瘤）以及不太常見的腫瘤類型（原發性腦腫瘤、神經內分泌腫瘤和惡性血液系統腫瘤）。有研究人員檢測了肺癌、結直腸癌和黑色素瘤標本中的BRAF突變，其中第600號密碼子以外的突變的發生頻率為37%；BRAF突變病例中75%為激酶激活變異，15%為激酶受損變異，10%激酶情況未知。在肺癌中，BRAF激酶受損變異可能比激酶情況未知的發生率要高得多。伴有激酶損傷的BRAF變異與KRAS或NRAS基因共發生的激活突變顯著相關。
BRAF突變可分為3類：第1類突變，僅為BRAF V600突變；第2類突變包括L597和K601（中/高激酶活性）；最後，第3類BRAF突變包括G466、D594和A581突變，導致激酶失活或激酶活性降低。RAF抑制劑很難在第3類突變驅動腫瘤中抑制ERK信號，因為RAF抑制劑優先抑制激活的BRAF V600突變。有證據表明，第3類突變還與RAS/MAPK激活增強有關，這可能是由於其他機制，如生長因子信號通路的激活或同時發生的MAPK通路突變，例如RAS或NF1。本文描述了一個在BRAF基因中發現了除V600E突變之外的病例，並且曲美替尼和達拉非尼治療有效。
病 例
一名75歲吸煙男性患者，被診斷為同時罹患右肺尖和右腎腫瘤，並轉移至縱隔和肺門淋巴結以及骨骼（圖1a，b）。腎活檢標本顯示低分化鱗狀細胞癌。隨後的開胸活檢結果也顯示為鱗狀細胞癌（p40[+]、CK7[+]、TTF1[−]、CK20[−]、CD10[−]、Vimentin[−]、Napisn A[−]、PAX8[−]）。在2%的腫瘤細胞中發現PD-L1的表達。患者的共病史包括心肌梗死後遺症、2型糖尿病、骨髓增生異常綜合徵（MDS）和痛風。
圖1. CT顯示右肺尖部腫瘤轉移至縱隔和肺門淋巴結(a)以及右腎轉移病灶(b)。
在腫瘤科會診後，患者接受卡鉑、紫杉醇和帕博利珠單抗進行化療聯合免疫治療。晚期肺鱗癌患者如果仍能保持良好的體力狀態（PS），應在一線治療選擇化療聯合免疫治療或免疫治療。化療聯合免疫治療方案包括帕博利珠單抗（pembrolizumab）聯合卡鉑和紫杉醇/nab-紫杉醇，以及納武利尤單抗和伊匹木單抗聯合兩個周期的含鉑化療。帕博利珠單抗或西米普利單抗（cemiplimab）可用於PD-L1表達≥50%的癌細胞的SqCC患者，阿替利珠單抗（atezolizumab）可用於PD-L1表達≥50%的癌細胞或免疫細胞≥10%的患者。僅在出現免疫治療禁忌症的情況下，才能單獨使用含鉑一線化療。EGFR、ALK和ROS1基因以及其他遺傳預測因子的檢測在非吸煙SqCC患者中有意義。當檢測到這些基因異常時，應在一線治療中使用分子靶向治療。二線含鉑化療用於一線單藥治療中接受免疫治療的患者。多西他賽單藥或聯合雷莫蘆單抗（ramucirumab，抗EGFR抗體）是一線接受化療聯合免疫治療患者的二線治療，也是免疫治療後接受含鉑化療患者的三線治療。如果免疫治療未用於一線治療（通常是出於非醫療原因），阿替利珠單抗、納武利尤單抗或帕博利珠單抗可用於二線治療。
由於MDS和中性粒細胞減少症並存，引入化療聯合免疫治療的決定被推遲，並給予粒細胞生長因子治療。患者接受了兩個周期的帕博利珠單抗減劑量化療。化療聯合免疫治療期間出現難以忍受的併發症，包括血小板減少。由於骨髓增生異常綜合徵和骨髓功能障礙，放棄進一步化療。患者繼續接受帕博利珠單抗治療7個周期，之後觀察到胸部（原發腫瘤大小增加，雙肺出現大量轉移性結節）、腹部（腎腫瘤增大）和骨骼的疾病進展（圖2a）。患者還接受了骨轉移的放射治療和雙膦酸鹽治療。
圖2. 在帕博利珠單抗維持治療期間CT掃描結果(a)；
後續使用達拉非尼和曲美替尼治療後，CT掃描顯示有效(b)
因此，對採集的肺部腫瘤標本進行了NGS檢測，測序結果顯示了已知和未知的致病突變。首先，在來自肺的FFPE（福馬林固定石蠟包埋）樣本中鑑定出BRAF （B-Raf原癌基因，絲氨酸/蘇氨酸激酶）基因（NM_004333）突變。該基因15號外顯子發生c.1781A>G（p.Asp594Gly, p.D594G）的取代。第二個有臨床意義的突變是NF1（神經纖維蛋白1）基因（NM_001042492）中的c.1381C>T （p.Arg461Ter, p.R461*）。第三個有臨床意義的基因變異是FANCC（范可尼貧血互補群C型）基因（p.Gln13Ter）中的C.37c>T突變。給予患者達拉非尼和曲美替尼治療，結果證實有效——肺腫瘤減小，骨轉移和腎轉移穩定（圖2b）。該治療方案持續了5個月。與之前帕博利珠單抗維持治療進展時的CT結果（圖2a）相比，右肺門的腫瘤腫塊（63×45 m㎡）情況穩定（圖2b）。與之前的檢查相比，轉移病灶減少：右肺第6段病灶從24mm減少到21mm，左肺第1/2段結節從11mm減少到9mm，右肺第2段結節從12mm減少到7mm。右肺主支氣管下方的淋巴結尺寸也從26mm縮小到20mm。根據RECIST v1.1標準，患者實現疾病穩定（SD）。病情穩定持續了5個月。在此之後，由於MDS進展導致紅細胞和血小板數量減少，患者的表現狀態惡化。治療停止。之後，患者疾病進展迅速，在開始使用BRAF和MEK抑制劑治療6.5個月後死亡。
在徵得盧布林醫學院生物倫理委員會同意的基礎上，患者書面同意參加這項研究。
討論
本文中患者的靶向治療涉及BRAF和MEK抑制劑。在一項2期研究的BRAF基因p.V600E突變的預治療（隊列B）和未治療（隊列C）患者中，達拉非尼聯合曲美替尼的療效已得到證實。B組和C組患者的客觀緩解率（ORR）分別為68.4%和63.9%，中位無進展生存期分別為10.2和10.8個月，中位總生存期分別為18.2和17.3個月。研究表明，使用單一BRAF抑制劑（維莫非尼，vemurafenib）治療非v600e突變的肺癌患者是無效的，因為藥物對非v600e的BRAF突變的親和力低或無親和力。然而，有報道稱，接受維莫非尼治療的BRAF p.L597R突變的黑色素瘤患者有部分緩解。使用達拉非尼聯合曲美替尼（阻斷BRAF和MEK），可能在BRAF非v600突變的患者中也有效，因為曲美替尼有效地阻斷了MAPK （MEK）通路（圖3）。有研究人員使用NGS技術發現了獨特的BRAF變異，包括非小細胞肺癌患者的擴增和錯義突變。3例非v600突變患者接受BRAF和MEK抑制劑治療。p.G469V和p.D594G突變的患者疾病進展迅速，而p.L597R突變的患者有持續的部分反應。一項研究顯示，一名T599dup突變的NSCLC患者在鉑類和培美曲塞化療失敗後，用達拉非尼聯合曲美替尼治療，實現了疾病穩定（SD），而一名K601E變異的患者出現了疾病進展（PD）。在BRAF基因15號外顯子發生的D594G突變（就像我們的病人）很可能降低了BRAF激酶的活性，但沒有使其失活（圖4）。該蛋白仍能傳遞信號，很可能是由於NF1失活導致的RAS過度激活而增強了BRAF激酶，因為NF1的失活可以在野生型患者中阻斷該蛋白。因此，達拉非尼（對非BRAF v600突變的癌細胞療效較差）和曲美替尼（阻斷MEK激酶）的協同作用似乎可以抑制增殖信號並導致腫瘤縮小。
圖3 BRAF和NF1信號轉導通路方案
圖4 達拉非尼與人BRAF激酶V600E或D594G突變的分子對接模型。
(A) BRAF激酶V600E突變體中的達拉非尼結合位點（紫色）呈現能量最低取向。此外，在BRAF激酶D594G突變體模型的復合物中顯示了能量最低的兩個取向（橙色和淺藍色）。右圖為達拉非尼與參與結合的殘基相互作用的3D圖。氫鍵用黑色箭頭標記，殘基用下劃線標註。配體取向呈現為球狀模式（左側）和棒狀模式（右側），而參與配體結合的殘基（右側）呈現為棒狀模式（氮為藍色，氧為紅色，氫為白色）。
(B) BRAF激酶V600E突變體中達拉非尼與結合位點相互作用的2D圖;
(C,D) BRAF激酶D594G突變體中達拉非尼以兩種（高親和力和低親和力）方向結合的2D視圖。
涉及達拉非尼結合的殘基顯示在圖中(B-D)。氫鍵用粉色箭頭標記，是疏水相互作用中的殘基。
達拉非尼在人BRAFp.V600E或p.D594G突變激酶模型中的分子對接
研究人員使用人BRAF激酶和達拉非尼復合物（2.66Å[埃]原子解析度，[PDB ID: 5CSW]）構建p.D594G突變體模型。此外，也使用BRAF激酶p.V600E突變體的晶體結構（2.65 Å原子解析度，[PDB ID: 4FK3]）用於分子建模研究。如前所述，達拉非尼的分子結構取自BRAF激酶與達拉非尼配合物的晶體結構。然後，使用半經驗AM1方法對該分子進行幾何優化。隨後將柔性達拉非尼分子與攜帶p.D594G或p.V600E突變的BRAF激酶模型進行分子對接。所選grid-box尺寸為34Å×30Å×30Å，grid-point間距為1Å，以確保覆蓋實驗所確定的人BRAF激酶中的達拉非尼結合位點。其中能量較低的結合方式被選中，如圖4所示。
分子對接結果表明，在攜帶p.D594G或p.V600E突變的BRAF激酶模型中，可能存在能與達拉非尼結合的位點和結構成分（圖4A）。在BRAF激酶p.V600E突變模型中，達拉非尼與疏水殘基（Phe468、Ile463、Val471、Ala481、Leu505、Leu514、Ile527、Trp531、Cys532、Ile582、Phe583和Phe595）和極性殘基（Ser465、Thr529、Gln530、Asn581和Asn580）相互作用。特別的是，Lys483與氟苯基和1，3-噻唑基之間存在陽離子-π相互作用。配體與Asp594和Asn580之間存在兩個氫鍵（圖4B）。
在BRAF激酶p.D594G突變體模型中，對接結果表明達拉非尼與V600E突變體的結合位點相同，但提出了幾種不同的取向，如圖4A所示。更具體地說，在每個呈現的方向上，分子與疏水殘基（Phe468, Ile463, Val471, Ala481, Leu505, Ile513, Leu514, Phe516, Ile527, Trp531, Cys532, Ile582, Phe583和Phe595）和極性（Ser465, Thr508, Thr529和Gln530）殘基相互作用。在每個取向上，達拉非尼與Lys483和Phe595之間至少存在兩個氫鍵（圖4C，圖4D）。在BRAF激酶p.D594G突變體模型中，陽離子-π與Lys483殘基和氟苯基或2-氨基-4-嘧啶基部分在每個方向上都存在相互作用。
綜上所述，分子對接結果與臨床數據基本一致。特別是，在BRAF激酶p.V600E和p.D594G突變模型中發現了相同的達拉非尼結合位點。
BRAF突變患者的分子背景
在患者的腫瘤FFPE樣本中發現了神經纖維蛋白1基因（NF1，NM_001042492）12號外顯子的突變c.1381C>T（p.Arg461Ter, pR461*）。該突變具有致病性，與1型神經纖維瘤病和遺傳性家族性癌症綜合徵有關。C>T的核苷酸替換導致胺基酸編碼從精氨酸變為終止密碼子。NF1基因是RasGAP家族的典型成員。NF1突變導致的功能喪失也在肺癌和許多其他癌症中有報道。NF1功能的失活使RAS蛋白保持在與GTP結合形式中，從而導致RAS蛋白的過度激活。TRK（酪氨酸激酶受體）-KRAS-BRAF-MEK-ERK通路的過度激活可能解釋了達拉非尼和曲美替尼對我們患者的有效性。因此，BRAF和MEK抑制劑的療效可能是由NF1失活引起的，而不是由BRAF突變。不能排除這兩種基因的改變都影響了這些藥物的療效。上述p.V600E和p.D594G突變改變的BRAF激酶與達拉非尼分子對接的結果證實，在p.D594G突變存在的情況下，達拉非尼與BRAF激酶的結合能力保持不變。
已有研究表明，NF1突變的肺癌患者大多為男性和吸煙者，而NF1突變的NSCLC患者代表了一種獨特的分子和臨床亞型的肺腺癌。研究人員使用NGS檢測了591例NSCLC患者。在60例（10%）患者中檢測到NF1基因突變，在141例（24%）患者中發現了KRAS基因突變。現已鑑定出72種NF1基因變異，其中48種NF1突變（錯義、無義和移碼）被預測有害。45例患者有獨立的NF1突變。在另外15例（25%）病例中，NF1突變與其他癌基因的突變同時發生：BRAF（p.C685S， p.G469V）， ERBB2（p.S310Y，p.V308L）， KRAS (p.G12D，p.G12V， p.G13C，p.G13D）， HRAS（p.Q61H）和NRAS（p.G13R）。
TP53（腫瘤蛋白P53）和STK11/LKB1（絲氨酸/蘇氨酸激酶11）是在NF1或KRAS基因突變的腫瘤中發現的最常見的突變抑制基因。此外，與KRAS突變隊列（46/132，35%）相比，NF1突變患者發生TP53突變或NF1雙等位基因缺失更頻繁（33/51，65%）。在本文的患者中，除了已知致病狀態的BRAF和NF1突變外，還觀察到TP53（p.H179R）、FANCC（p.Q13*）、NOTCH1（p.Y708fs*9）、EPHB1（p.R56L）和TET2（p.N752fs*59）變異。此外，在CDKN2A/B（周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A/B）p16INK4a基因（p.D108G）中發現了一個致病意義未知的變異。這些基因通常被描述為腫瘤抑制因子，儘管在某些情況下這是有爭議的。在10%的NSCLC患者中可能存在NOTCH1突變激活，而在30%的NSCLC患者中可以看到NUMB（NOTCH的負調控因子）的表達降低。這提示NOTCH1的表達隨組織病理學亞型的不同而存在差異，NOTCH1的過表達與NSCLC的疾病進展和不良預後有關。然而，也有研究表明NOTCH1過表達與抑制淋巴結轉移和非小細胞肺癌的進展有關。CDKN2A/B p16INK4a腫瘤抑制基因的突變是描述最好的突變之一，並與許多類型的腫瘤有關。COSMIC資料庫顯示，該基因的p.D108G變體具有致病性（體系變異）。然而，目前還沒有關於這種突變對蛋白質功能影響的報道。密碼子D108（D108H，D108Y）的改變會導致周期蛋白依賴性激酶抑制劑的不穩定和細胞周期控制的喪失。
對患者的游離循環腫瘤DNA進行測序，結果證實了前面提到的突變的存在。此外，還發現了TP53基因的另一個突變：c.733G>A（p.Gly245Ser）。在遺傳性癌症綜合徵和李法美尼症候群（Li-Fraumeni syndrome，LFS，李-佛美尼綜合症）中，它被描述為具有致病性的胚系變異。然而在肺鱗癌中，TP53被描述為可能具有致病性，並存在體系變異。在腫瘤和液體活檢材料中都發現了TP53基因中的c.536A>G（p.His179Arg）變體，這與ClinVar資料庫中對致病性的解釋之間存在矛盾。大量報道表明，這種突變具有致病性，這種體細胞變異發生在許多癌症中，包括小細胞肺癌和肺鱗癌。
有證據表明，與單基因預測相比，共突變可能是治療反應的更精確的生物標誌物。BRAF突變NSCLC患者的分子改變包括以下基因的突變：TP53（53.3%）、STK11（16.2%）、ATM（共濟毛細血管失調擴張突變基因）（5.8%）、NF1（6.9%）、PIK3CA（6.6%）、KEAP1（6.6%）、MYC（MYC原癌基因，BHLH轉錄因子）（10.8%）、NKX2-1（7.3%）。這些數據涉及腺癌，而我們的患者被診斷為疑似肺鱗癌，這種組織學類型的BRAF突變極其罕見（0.3%）。BRAF基因突變在肺鱗癌中出現的頻率略高於其他鱗癌。本例患者肺部腫瘤的組織病理學檢查不排除腫瘤原發於肺外的可能，腎臟低分化鱗狀細胞轉移腫瘤的模糊免疫組織化學檢查可能表明這一點（p40[+]，p63[+]，CK7[+]， CK5/6[+]，Vimentin[+]，CD10[+/−]，GATA3[−]，Napisn A[−]，CK20[−]，PAX8[−]，TTF1[−]，Ki67/MIB1[80%細胞中+++]）。在原發灶不明的癌症（Cancer of Unknown Primary, CUP）中，免疫組化診斷困難，往往不能明確地回答轉移的起源部位。有相關專家研究了252例CUP。對來自最早隊列的54例患者進行了回顧性分析，剩餘的198例患者在診斷後立即進行了NGS並取得結果。研究人員發現了以下基因突變的存在：TP53（49.6%）、CDKN2A（19.0%）、NOTCH1（14.1%）、KRAS（23.4%）、FGFR4（14.9%）和PIK3CA（10.7%）。在198例患者的亞群中，3.5%的人群存在BRAF突變。
在我們的患者中，我們還在FANCC（FA互補組C）基因的13號密碼子處發現了移碼突變（C.37c>T，p.Gln13Ter），這是一個終止型的致病性胚系變異。FANCC基因突變與范可尼貧血有關，范可尼貧血是一種染色體不穩定、對DNA交聯劑過敏、大量染色體斷裂和DNA修復缺陷的疾病。此外，FANCC基因突變的存在增加了遺傳性癌症的易感性，也增加了胰腺癌、結直腸癌、乳腺癌和肺癌的發展風險。有一例55歲的患者，診斷為肺腺癌，經手術切除和化療治療後出現結直腸腺癌。息肉切除後，診斷為腎鱗狀細胞癌。研究人員打算探尋腫瘤病變的起源。在對這三個腫瘤組織樣本進行免疫組化檢查後，結果是不確定的，正如本文先前描述的病例。研究人員對三個腫瘤樣本中的520個癌症相關基因進行了測序。他們發現，肺癌和腎癌組織的突變與結直腸癌組織非常相似，但也存在不同。根據測序數據，研究人員認為肺癌和結腸癌是原發腫瘤，而腎癌是肺癌的轉移的結果。在所有三個癌症樣本中都觀察到FANCC（FANCC p.W113X）突變，證實為患者淋巴細胞的胚系變異。在病人的兒子身上也發現了相同的FANCC變異，幸運的是，他在檢測時身體健康。更重要的是，患者的父親患有結腸直腸癌，這推動了遺傳性癌症綜合徵的診斷。
FANCC參與基因組穩定的維持，並被認為是一種腫瘤抑制因子。在我們的患者中發現的p.Gln13Ter失活突變是FANCC抑制活性消除的扳機，這可能與疾病的更壞的臨床病程有關。此外，FANCC基因突變的患者發生急性髓系白血病（AML）和骨髓增生異常綜合徵（MDS）的風險增加，這是有據可循的。可以認為，本文患者MDS的發展是由FANCC基因的遺傳突變引起的。MDS的最初症狀也在患者的女兒身上出現，而她目前還沒有進行基因檢測。
總結
在本文描述的臨床病例中，腫瘤抑制因子的失活似乎促進了腫瘤的發展，並可能參與了共病（MDS，骨髓異常增生綜合徵）的發生髮展。儘管這些變異不是明確符合分子靶向治療的條件，但它們可能與預後較差、疾病進展時間和總生存期縮短有關。BRAF致癌基因和NF1腫瘤抑制基因的突變是使用達拉非尼和曲美替尼治療的原因。患者在短期內病情穩定。這證明了這些基因的共存突變會影響病程和療效。必須注意患者的共病，包括MDS——這一病症的出現使治療變得複雜。在FANCC基因中發現的突變可能提示我們的患者具有癌症和MDS發展的遺傳易感性。據了解，范可尼貧血患者罹患骨髓衰竭、MDS、白血病、頭頸部鱗狀細胞癌等實體瘤的風險非常高。該患者經歷了與MDS病程相關的惡化，儘管患者在接受了達拉非尼和曲美替尼治療後，腫瘤明顯縮小，遺憾的是，患者最終死亡。
參考文獻：
Grenda, A.; Krawczyk, P.; Targowska-Duda, K.M.; Kieszko, R.; Paśnik, I.; Milanowski, J. Efficacy of Dabrafenib and Trametinib in a Patient with Squamous-Cell Carcinoma, with Mutation p.D594G in BRAF and p.R461* in NF1 Genes—A Case Report with Literature Review. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 1195. https://doi.org/10.3390/ijms24021195